آزمایـش QF-PCR

 آزمایـش QF-PCR  مخصوصـاً در مـواردی کـه محدودیـت زمانـی بـرای انجـام آزمایـش کاریوتایـپ وجـود دارد، مناسـب تـر اسـت. از آنجایی که در ایران بعد از هفته 18 بارداری سقط درمانی غیر قانونی می باشد لازم است نتایج همه آزمایش‌ها تا قبل از اتمام هفته 18 بارداری مشخص شوند. لذا توصیه می شود چنانچه در مراجعات خانمها برای انجام آزمایش‌های کروموزومی، سن بارداری بعد هفته 15 باشد از روش بررسی سریع اختلال کروموزومی موسوم به  QF-PCR استفاده کرد. این روش معمولا در عرض 48 ساعت به نتیجه می رسد ولی بررسی کروموزومی 2-4 هفته به طول می انجامد.

بررسی کروموزومی نمونه جنینی برای چه افرادی توصیه می شود؟

• سن بالای ۳۵ سال در هنگام بارداری

• جواب آزمایشات حین بارداری (موسوم به تست سه گانه یا چهارگانه، Triple Test, Quadruple Test) مشکوک به وجود اختلالات کروموزومی باشد.

• جواب سونوگرافی حین بارداری مشکوک به اختلال کروموزوم در جنین باشد.

• داشتن فرزند مبتلا به اختلال کروموزومی(زنده یا فوت شده)

• داشتن اختلال کروموزومی متعادل در خود یا همسر

• درخواست آزمایش کروموزومی حین بارداری توسط پزشک

انواع تست‏های تشخیصی ژنتیکی بعد از انجام تست  های اولیه غربالگری چیست؟

1) کاریوتایپ جنین (از نمونه آمنیون یا پرزهای کورریونی)

2) هیبریداسیون فلورسانس درجا  (FISH)

3) تست QF-PCR 

آزمایش کاریوتیپ چیست؟

مجموعه ویژگی های کروموزومی یک گونه مشخص را کاریوتایپ می گویند. در کاریوتایپ بررسی تعدادی و ساختاری کروموزوم ها صورت می گیرد و یکی از روش های تشخیصی دقیق و مهم در پزشکی جهت تشخیص تعداد زیادی از بیماری های ژنتیکی  است. بررسی تغییرات کروموزومی در یک فرد با انجام آزمایش کاریوتیپ امکان پذیر است. کاریوتایپ تصویری است که از کروموزم‌های یک فرد گرفته می‌شود و در آن تعداد و ساختار کروموزوم‌ها مشخص می‌شود. این آزمایش شامل بررسی میکروسکوپی کروموزوم های افراد و مرتب کردن آنها بر اساس ویژگی های خاص می باشد. به این ترتیب می توان تغییر در تعداد کروموزوم ها و یا تغییرات بزرگ ساختاری آنها را تشخیص داد. در نوع اصلاح شده این آزمایش که کاریوتایپ با قدرت تفکیک بالا نام دارد می توان تغییرات کروموزومی کوچکتر را تشخیص داد. برای انجام آزمایش کاریوتیپ ابتدا سلول‌های خون، مغز استخوان، یا بافت‌های جنینی در محیطی سرشار از مواد غذایی و ویتامین های لازم و در حضور مواد تحریک کننده رشد سلولی تکثیر می‌شوند. سپس سلول‌ها در مرحله‌‌ای از چرخه سلولی که در آن کروموزوم‌ها قابل تشخیص باشند متوقف ‌می‌شوند. در مرحله بعدی کروموزوم‌ها رنگ آمیزی و به دقت زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار می‌گیرند. سپس از آن ها عکس تهیه می شود و ترتیب کروموزوم ها مشاهده می گردد. آزمایش کاریوتایپ معمولاً به صورت G-Banding معمولی و یا با تفکیک پذیری بالا انجام می گیرد. مراحل انجام آزمایش شامل : کشت، برداشت، لام گیری یا گستره کروموزومی، رنگ آمیزی کروموزومها و بررسی دقیق زیر میکروسکوپ می باشد.

تست هیبریداسیون فلورسانس درجا (FISH) چیست؟

• روش FISH  از پروبهایی نشاندار شده با رنگهای فلورسانس و از جنس DNA و مکمل مناطق خاصی از کروموزوم استفاده می شود. این پروبها بطور اختصاصی به محل خود چسبنده و نور ساطع شده از آنها با میکروسکوپ فلورسانس مشاهده می گردد. در صورت عدم وجود آنوپلوئیدی از هر پروب دو نشان، در صورت وجود تریزومی سه نشان و در صورت وجود مونوزومی یک نشان مشاهده می  گردد.

تست کیو اف پی سی آر ( QF-PCR) چیست؟

کیو اف پی سی آر (Quantitative Fluorescence- Polymerase Chain Reaction) QF-PCR یک روش آزمایشگاهی ارزان، سریع و قابل اطمینان برای تشخیص ناهنجاری در کروموزوم های ۱۳، ۱۸، ۲۱، X و Y (ناهنجاری های شایع تر) می باشد.  در این روش بخش کوچکی از DNA جنین را تکثیر کرده و یکسری از جایگاه ها یا STR (Short Tandem Repeat) را روی DNA مورد بررسی قرار می­دهد. QF-PCR به طور عمده به عنوان یک آزمون سریع قبل از تولد برای تشخیص تریزومی­های شایع 21، 18، 13 و تریزومی­های جنسی X و Y استفاده می شود که شایعترین آنها 21 می­باشد. با استفاده از روش QF-PCR ناهنجاری های کروموزومی تا حدود ۹۹% از خانواده های مراجعه کننده می تواند قابل تشخیص باشد.

مزایای اصلی روش QF-PCR دقت، سرعت و کم هزینه بودن این تست نسبت به دیگر تست­های ژنتیکی می­باشد که این امکان را به وجود می آورد ناهنجاری های کروموزومی پیش از تولد تشخیص داده شوند. این احتمال وجود دارد که در آینده ای نزدیک، این روش جایگزین روشهای ژنتیکی گردد.

تست QF-PCR در چه مواردی استفاده می شود؟

• بررسی سلامت جنین در صورت مشکوک بودن نتایج غربالگری سه ماهه اول

• تعیین جنسیت جنین

• تشخیص سریع اختلالات کروموزوم های آتوزوم شامل سندرم داون(+۲۱)، سندرم ادوارد(+۱۸) و سندرم پاتو (+۱۳)

• تشخیص سریع اختلالات کروموزوم های جنسی X و Y (سندرم ترنرXO، سندرم کلاین فلترXXY، سندرم X سه گانه XXX، سندرم جاکوب XYY)

• تشخیص انواع پلی پلوئیدی (تریپلوئیدی) در جنین یا جنین سقط شده

• بررسی سریع اختلالات کروموزومی در مواردی که امکان کشت سلولی فراهم نباشد و یا زمان کافی برای کشت سلولی ندارند.

مراحل کار QF-PCR چگونه است؟

1)  در خواست آزمایش توسط پزشک

2)  مراجعه به پزشک متخصص زنان و زایمان جهت اخذ نمونه جنینی (پرزهای کوریونی و یا مایع آمنیون)

3) استخراج DNA از نمونه جنینی

4) انجام PCR با استفاده از کیت اختصاصی QF-PCR

5) آنالیز نمونه ها درون دستگاه Genetic Analyzer

6) آنالیز نهایی نمونه ها با استفاده از نرم افزار Mapper Gene

تفاوت های روش QF-PCR با روشهای سیتوژنتیکی مرسوم (FISH و  تهیه کاریوتایپ) چیست؟

در روش QF-PCR برخلاف روش کاریوتایپ نیازی به کشت سلولهای آمنیون نمی باشد لذا در  هزینه و زمان صرفه جویی خواهد شد.

در مقایسه با هزینه نسبتا بالای آزمایش های کروموزومی هزینه این آزمایش کمتر از نصف می باشد.

در روش FISH  هزینه ای که فرد متقبل می شود در مقایسه با روش QF-PCR بیشتر است.

در مواردی که نمونه جنینی با سلولهای مادری آلوده شده باشد امکان رسیدن به جواب صحیح توسط QF-PCR نسبت به دو تکنیک دیگر بیشتر خواهد بود.

دقت این روش در مقایسه با روشهای سیتوژنتیکی بیش از ۹۹ درصد می باشد.

بررسی با روشهای تهیه کاریوتایپ معمولاً بیشتر از ۲ هفته طول می کشد در صورتیکه با روش مولکولی QF-PCR به کمتر از ۴۸ ساعت زمان نیاز است.

با استفاده از نمونه غیر زنده (مانند جنین سقط شده یا مرده زاد یا فوت بعد از تولد) می توان آزمایش QF-PCR را انجام داد در صورتی که با روشهای سیتوژنتیکی نمونه می بایست از موجود زنده تهیه شود.

نمونه های مورد نیاز جهت انجام QF-PCR 

با این روش می توان بر روی نمونه های پرزهای جنینی (CVS) در هفته های 10 تا 12 یا مایع آمنیون در هفته 14 تا 16 بررسی ها انجام گردد. در برخی موارد که در هنگام نمونه برداری، نمونه جنینی با خون مادر آلوده می شود، نمونه خون وریدی مادر هم مورد نیاز خواهد بود تا بتوان با کمک این روش احتمال آلودگی نمونه جنینی با سلول های مادر را تعیین نمود.

محدودیت های تکنیک PCR-QF چیست؟

1. در ایـن روش درجـات پائیـن موزائیسـم و آنوپلوئیدهـا، که سـلولهای ناهنجـار کمتـر از 15 تـا 20 درصـد از رده سـلولی را تشـکیل دهنـد، قابل تشـخیص نیسـتند.

2. روشـی قابـل اطمینان برای تشـخیص حذف هـای کروموزومی نمی باشـد.

3.  در مـوارد بسـیار نـادری جـواب آزمایش نمـی تواند گویای وضعیـت کلیـه مارکرهـا بـر روی یک یا چنـد کروموزوم باشـد. در ایـن مـوارد نمونـه ها بـه روش FISH یـا کاریوتایـپ مورد بررسـی قرار خواهنـد گرفت.

4. در حال حاضر این روش قادر به بررسی همه کروموزوم ها نمی باشد و تنها 5 کروموزوم 21 و 18 و 13 و X و Y را شناسایی می نماید.

QF PCR در چه مواردی استفاده می شود؟

1. تشخیص سریع اختلالات کروموزوم های آتوزوم  شامل سندرم داون(+21)، سندرم ادوارد(+18) و سندرم پاتو (+13)

2. بررسی سلامت جنین در صورت مشکوک بودن نتایج غربالگری سه ماهه اول

3. تعیین جنسیت جنین

4. تشخیص سریع اختلالات کروموزوم های جنسی X و Y (سندرم ترنرXO، سندرم کلاین فلترXXY، سندرم X سه گانه XXX، سندرم جاکوب XYY)

5. تشخیص انواع پلی پلوئیدی(تریپلوئیدی) در جنین یا جنین سقط شده

6. بررسی سریع اختلالات کروموزومی در مواردی که امکان کشت سلولی فراهم نباشد و یا زمان کافی برای کشت سلولی ندارند.

منابعی برای مطالعه بیشتر:

1) Prenatal Screening for Aneuploidy in Iranian Families Using QF-PCR. gene3m. 2011;9(2):2360-6.

Yi W, Yan-Lin W, Chun-Min L, Xu H, Wen-Jing H, et al (2015) Comparison of Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) and Conventional Cytogenetic Analysis in Detection of Fetal Anueploidies. J Womens Health, Issues Care 4:6.

Comas C, Echevarria M, Carrera M, Serra B. Rapid aneuploidy testing versus traditional karyotyping in amniocentesis for certain referral indications. The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine. 2010;23(9):949-55.