آزمایش های تخصصی لازم برای گیرندگان و اهداکنندگان پیوند اعضا

| تعداد بازدید : 1118

یکی از چالش های مهم در پیوند اعضا، کنترل پاسخ های ایمنی همورال و سلولی جهت جلوگیری از رد پیوند می باشد.  برای این منظور پنلی از آزمایش های پیش از پیوند ضروری است. یکی از این آزمایش ها بررسی آنتی ژن های دخیل در پیوند است که به نام HLA  خوانده می شوند. از مهمترین روش ها ، روش سرولوژیک و روش های مولکولی هستند، همچنین به علت حضور آنتی بادی ضد HLA پیش از پیوند در 2/3  گیرندگان، غربالگری آنتی بادی ضد HLA نیز از تست های ضروری پیش از پیوند است. غربالگری آنتی بادی به روش های مختلفی نظیر Panel reactiv antibody (PRA)  و فلوسایتومتری انجام می گیرد.

آزمایش های تخصصی لازم برای گیرندگان و اهداکنندگان پیوند اعضا

مطالعات Medawar و همکارانش منجر به کشف آنتی ژن های لکوسیتی گشت که امروزه به نام Human Leukocyte Antigen یا HLA خوانده می شوند. ژن های کد کننده HLA روی بازوی کوتاه کروموزوم 6 (6p21.31) قرار گرفته و محدوده ای به طول 3.6 Mbp را پوشش می دهند  (شکل1، a). مولکول های HLA در زمینه های متفاوتی نظیر ایمنی علیه عفونت، خودایمنی و سرطان ایفای نقش می کنند. یکی از مهم ترین وظایف مولکول های گلیکوپروتئینی HLA نقش این مولکول ها در شناسایی خودی از غیر خودی و در نتیجه عملکرد آن ها در رد پیوند است.  ژن های HLA به دو دسته اصلی تقسیم می شوند؛ کلاس I کلاسیک ( HLA-A, -B, -C) که زنجیره سنگین آن ها توسط ژن های HLA-A، HLA-B و HLA-Cw کد شده و زنجیره سبک آن ها مولکول β2 میکروگلوبولین است. این مولکول ها در سطح تمانی سلول های هسته ار بدن بیان شده و مسوول عرضه آنتی ژن درونزاد (Endogenous)  به سلول های T سایتوتوکسیک (CTLs) می باشند. آنتی ژن های کلاس II (HLA-DR, -DP, -DQ) که زنجیره βآن ها توسط ژن های HLA-A، HLA-B و HLA-C کد می شوند. مولکول های کلاس II تنها در سطح سلول های B، ماکروفاژها و سایر سلول های عرضه مننده آنتی ژن (Antigen Presenting Cell) بیان شده و مسوول عرضه آنتی ژن های برونزاد (Exogenous) به سلول های T helper هستند. این مولکول ها مسوول محصولات این ژن ها مسوول عرضه آنتی ژن به سلول هایT و تحریک پاسخ ایمنی است. به طور کلی پلی مورفیسم زنجیره بتا نسبت به زنجیره آلفا بسیار بیشتر است.  به همین دلیل تعیین HLA روی زنجیره β انجام می گیرد (شکل 1، b).

شکل  1 (aموقعیت کروموزومی                             b (ساختار مولکول های HLA

یکی از ویژگی های اصلی HLA پلی مورفیسم شدید آن است به طوری که بیشترین میزان پلی مورفیسم در ژنوم انسانی در جایگاه ژنی (لوکوس) HLA وجود دارد و تعداد آلل های شناخته شده به طور مداوم در حال افزایش است به طوری که برای مثال بیش از 4000 ژن هم ردیف (آلل) شناخته شده تنها برای HLA-B وجود دارد.

یکی از دغدغه های اصلی در بیماران پیوندی، یافتن دهنده مناسب است که جز با استفاده از تست های مناسب امکان پذیر نمی باشد. تمامی این تست ها بر پایه بررسی HLA دهنده و گیرنده پیوند و گزینش HLA یکسان یا مشابه بین دهنده و گیرنده است. بررسی HLA یا HLA-typing با روش های متععدی انجام می گیرد که در زیر به بررسی این موارد می پردازیم.

 

روش سرولوژیک HLA-typing در پیوند اعضا

در این روش از سرم های مختلف حاوی آنتی بادی های شناخته شده علیه آلل های مختلف HLA استفاده می شود. امروزه نمونه سرم حاوی آنتی بادی علیه آلل های شایع و نادر HLA به صورت تجاری تولید می شود. لنفوسیت های گیرنده  که حاوی مولکول های HLA است با این سرم ها مجاور شده و سپس با کمپلمان و رنگ حیاتی انکوبه می شوند.

در صورت حضور HLA خاص در سطح سلول، این آنتی ژن به آنتی بادی متصل شده، کمپلمان فعال شده و کمپلکس حمله به غشاء تشکیل می شود. به این ترتیب و با مرگ سلول، رنگ حیاتی به داخل سلول نفوذ می کند. مرگ سلولی در چاهک های مختلف با میکروسکوپ فاز کنتراست بررسی خواهد شد.

مزایای روش سرولوژیک عبارتند از:

  •  تسریع انجام تست توانایی

  •  افتراق آلل نول HLA که توالی DNA قابل تشخیص داشته ولی فاقد بیان پروتئینی هستند.

معایب روش سرولوژیک شامل موارد زیر هستند:

  •  امروزه نقش HLA-C، HLA-DQ و HLA-DP در تعیین سرنوشت پیوند شناخته شده، لذا HLA-typing در مورد این مولکول ها ضروری است در حالی که روش های سرولوژیک برای این جایگاه ها محد.دیت دارند.

  •  تفاوت های جزئی اسید آمینه در پروتئین HLA به راحتی با استفاده از روش های سرولوژیک قابل شناسایی نمی باشد در حالی که این تفاوتهای جزئی در تعیین سرنوشت پیوند اهمیت بالایی دارند.

 

روش مولکولی در پیوند اعضا

با توجه به توالی مشخص ناحیه DNA مسوول کد کردن پروتئین های HLA، امروزه استفاده از روش های HLA-typing مولکولی با کمک تکنیک PCR به سه شکل  Sequence specific primer polymerase chain reaction (SSP-PCR)، Sequence specific oligonucleotide probe  (SSOP) و توالی یابی مستقیم DNA به  شدت رو به رشد است.

در روش SSP-PCR، DNA فرد جدا شده و در چندین چاهک که هر کدام حاوی پرایمرهای مکمل یک آلل خاص HLA هستند، تکثیر می شود. محصول تکثیر در هر چاهک زمانی تشکیل می شود که پرایمر موجود در آن چاهک مکمل توالی مولکولی HLA باشد. محتوای چاهک ها سپس با روش الکتروفورز و روی ژل بررسی می شوند که در این حالت محصولات تکثیر شده به صورت باند روی ژل ظاهر می شوند.

در روش SSOP، پرایمرهای مکمل نواحی منحصر به فرد DNA آلل های مختلف، با DNA تکثیر شده مخلوط می شوند. برچسب های فلورسنت خاص، پرایمر هایی که مکمل DNA هستند را تشخیص می دهد و به این ترتیب آلل های HLA خاص مشخص می شوند.

توالی یابی ترتیب دقیق نوکلئوتیدها در ژن موردنظر و در نهایت نوع HLA را پس از مقایسه با توالی آلل های موجود از قبل مشخص می کند.  روش های مولکولی روشی بسیار دقیقی برای تعیین تفاوت های بین HLA دهنده و گیرنده محسوب می شود.

 

نامگذاری HLA در پیوند اعضا

نامگذاری WHO با نام جایگاه ژنی آغاز می شود و نهایتا 4 بخش را شامل می شود. هر بخش از بخش دیگر با یک (: )جدا می شود و هر بخش گویای سطوح متفاوتی از تنوع سکانس DNA و در نتیجه پروتئین است. بخش اول نشانگر گروه ژن های همردیف (آللی) است که با نتایج سرولوژیک همخوانی دارد. گزارش نتایج در این بخش  به نام تفکیک 2D -به علت استفاده از دو شماره -خوانده می شود. بخش دوم نشانگر تفاوت در توالی DNA است که منجر به تفاوت در توالی اسیدهای آمینه و پروتئین می شود. بخش دوم به دلیل استفاده از 4 شماره به نام D4 نامیده می شود. بخش سوم گویای جایگزینی اسید های نوکلئیک در بخش کد کننده پروتئین و بخش چهارم نشانگر تفاوت در بخش غیر کد کننده است. از جایی که تفاوت در بخش سوم و چهارم تاثیری در محصول پروتئینی ندارد لذا HLA-Typing این دو بخش ضروری نیست.

در انتهای نام آلل HLA، ممکن است یک پسوند اضافه شود که گویای تغییرات بیان محصول پروتئینی است (N: آلل نول (عدم بیان پروتئین)، L: بیان ضعیف، Q: بیان نا معلوم). آلل های نول عموما باید مستثنی شده یا تایید شوند ) شکل 2 a  و b (.

 

شکل 2. روش های مختلف نامگذاری HLA

a) نامگذاری به روش سرولوژیک                    b) نامگذاری به روش مولکولی

 

میزان تفکیک مورد نیاز

به طور کلی جهت پیوند اعضای توپر، تفکیک دو عددی که انواع HLA را از نظر سرولوژیک افتراق دهند کفایت می کند. برای بانک مغز استخوان تفکیک حداقل جهت غربالگری، کم تا متوسط است. البته اکثر بانک های مغز استخوان جهت افزایش شانس انتخاب دهنده مناسب از تفکیک 4 عددی (High resolution) استفاده می کنند.

 

غربالگری آنتی بادی ضد HLA در پیوند اعضا

تقریبا یک سوم از بیماران موجود در لیست انتظار دارای آنتی بادی ضد HLA هستند. تولید این آنتی بادی ها به دنبال حساس شدن فرد در برخورد با مولکول های مختلف HLA طی بارداری قبلی، انتقال خون و یا پیوند قبلی رخ می دهد. از تبعات حضور این آنتی بادی ها، افزایش احتمال مثبت شدن کراس مچ در صورت بالا بودت تیتر آنتی بادی و حذف دهنده از لیست می باشد. حتی در صورت پایین بودن تیتر آنتی بادی و منفی شدن کراس مچ، احتمال بروز مواردی نظیر رد پیوند وجود دارد. بنابراین تشخیص حساس و اختصاصی آنتی بادی ضد HLA جهت تعیین ریسک احتمالی در گیرنده پیوند ضروری است. به این ترتیب غربالگری آنتی بادی پیش از پیوند در بیماران لیست انتظار حائز اهمیت است.

 

غربالگری آنتی بادی سایتوتوکسیک در پیوند اعضا

سلول های 40-20 نفر از افراد دهنده به صورت تصادفی انتخاب شده به این ترتیب لنفوسیت های این افراد پانل سلولی را تشکیل می دهند. گرچه این سلول های دهنده، اندام دهنده محسوب نمی شوند ولیکن HLA-typing  آن ها معرف توزیع آنتی ژن در جمعیتی است که حتی دهندگان مرده نیز از این جمعیت انتخاب می شود. به این ترتیب درصدی از پانل سلول های دهنده که یک گیرنده خاص علیه این سلول ها تولید آنتی بادی دارد تخمینی از درصد دهندگان عضو همان جمعیت به دست می دهد که احتمالا کراس مچ مثبت دارند. اساس این روش مشابه روش سرولوژیک است با این تفاوت که در این روش سرم گیرنده با پانل سلول های دهنده، کمپلمان و رنگ مجاور می شود.

اگر در یک پانل 40 سلولی، در 30 چاهک مرگ سلولی قابل توجه مشاهده شود، Panel Reactive Antibody (PRA) 75% گزارش خواهد شد.

این تفاسیر بر دو فرض استوار هستند: مورد اول این که تمامی آنتی بادی ها قادر به القای رد پیوند در این روش شناسایی شده و دوم این که تمامی آنتی بادیهای شناخته شده در رد پیوند ضروری هستند.

در بسیاری موارد آنتی بادی های شناخته شده در روش سایتوتوکسیک نه مولکول های HLA را شناسایی می کنند و نه واسطه رد پیوند هستند. به علاوه  اگرچه آننی بادی های کلاس IgM قادر به فعالسازی کمپلمان هستند ولیکن از نظر بالینی فاقد اهمیت هستند. به این ترتیب این روش به دلیل واکنش های مثبت کاذب بالا ویژگی ضعیفی نشان می دهد.

 

از طرفی روش سایتوتوکسیک همچنین مستعد  نتایج منفی کاذب نیز هست. برای مثال تیتر پایین آنتی بادی قادر به فعالسازی کمپلمان in vitro  نمی باشد. به علاوه برخی از انواع زیر کلاس های آنتی بادی قادر به تثبیت کمپلمان نبوده در حالی که می توانند از طریق برهم کنش با گیرنده Fc سلول های التهابی رد پیوند را واسطه گری کنند. از طرفی توزیع آنتی ژن های HLA روی سایر جمعیت های سلولی ممکن است منجر به نتایج منفی کاذب شود.

با توجه به استفاده از لنفوسیت های دهنده در روش سایتوتوکسیک از طرفی و الگوی توزیع آنتی ژن های کلاس II از طرف دیگر، می توان نتیجه گرفت که این آنتی ژن ها، علیرغم اهمیت بالینی آن ها در این روش بررسی نخواهند شد.

 

غربالگری آنتی بادی سایتوتوکسیک با استفاده از فلوسیتومتری

استفاده از روش فلوسیتومتری بر بسیاری از مشکلات فوق غلبه کرده است.

حساسیت تشدید شده به وسیله ایمونوفلورسانس مستقیم در استفاده از روش فلوسیتومتری، بر مشکل تیتر پایین آنتی بادی غلبه می کند. استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال اختصاصی امکان تفکیک جمعیت های سلولی مختلف جهت تشخیص آنتی بادی ضد HLA کلاس I یا II را فراهم می سازد. به علاوه توانایی فلوسایتومتری در عملکرد مستقل از کمپلمان، شناسایی تمامی آنتی بادی های با اهمیت کلینیکی بالا را ممکن می سازد. از طرف دیگر استفاده از پروب های اختصاصی از کلاس IgG منجر به حذف نتایج مثبت کاذب مرتبط با کلاس IgM خواهد شد.

یکی از مشکلات مهم در استفاده از روش Flow cytometric PRA cell-based عدم امکان استفاده از سلول های زنده در مواردی است که دهنده عضو مرده باشد. به این منظور از روش PRA با استفاده از بید استفاده می شود (Flow cytometric PRA bead-based) که در این روش بید های پوشیده از آنتی ژن جایگزین سلول های دهنده شده اند. در روش  Flow cytometric PRA bead-based به دلیل استفاده همزمان از چندین آنتی ژن روی هر بید، در صورت مثبت شدن واکنش امکان تفکیک آنتی ژن های روی بید از یکدیگر وجود ندارداز طرفی در افرادی که قبلا با واسطه انتقال خون، بارداری های متعدد یا پیوند قبلی، حساس شده اند آنتی بادی ضد HLA (PRA) در مقادیر بالا تولید می شود (PRA≥ 85%). راه حل قطعی پیوند برای این افراد یافتن یک دهنده یکسان از نظر HLA است. در این شرایط جهت تعیین HLA یکسان، تفکیک آنتی ژن های موجود در سطح بید از یکدیگر ضروری است. یکی از روش های مورد استفاده جهت رفع این مشکل بررسی سرم گیرنده در مجاورت بید های پوشیده از آنتی ژن HLA منفرد است (Single antigen bead یا SAB).

 

شکل 3. انواع روش های غربالگری آنتی بادی

 a) غربالگری آنتی بادی با استفاده از سلول   b) غربالگری آنتی بادی با استفاده از بید

 

 

کراس مچ در پیوند اعضا

در سال 1969 Patel و Terasaki برای اولین بار ثابت کردند که گیرنده های دارای آنتی بادی اختصاصی علیه دهنده (Donor specific antibody یا DSA) در سرم نسبت بسیار بالاتری از رد پیوند فوق حاد را نشان می دهند. روش پیشنهادی آن ها سنجش سایتوتوکسیک بود که پیشتر و در بخش روش سرولوژیک و PRA به آن اشاره شد.

به این ترتیب تست کراس مچ سایتوتوکسیک سلول T به عنوان تست ضروری پیش از پیوند در سراسر جهان به کار گرفته شد که منجر به کاهش چشمگیر در رد پیوند فوق حاد گشت. به این ترتیب تشخیص آنتی بادی سایتوتوکسیک اختصاصی دهنده (کراس مچ مثبت) منجر به منع انجام پیوند می شد.

بر خلاف PRA که  در آن تمامی آنتی بادی های علیه مجموعه ای از دهندگان شناسایی می شود، کراس مچ تنها به تشخیص آنتی بادی گیرنده علیه یک دهنده خاص می پردازد. علیرغم تمامی پبشرفت های حاصل در مقایسه با نبود این تست، کراس مچ سایتوتوکسیک دارای  4% نتایج منفی کاذب و 20% موارد مثبت کاذب است که به این ترتیب یا منجر به عدم شناسایی تمامی آنتی بادی های موجود در گیرنده شده و یا به حذف دهنده مناسب می انجامد. در گذر زمان این روش در راستای رفع این مشکلات تغییر کرده وبهترین تکنیک های مورد استفاده جهت تعیین بیشترین تعداد آنتی بادی هایی گیرنده علیه دهنده به کار گرفته شده اند.

مقایسه قابلیت های تشخیص انواع آنتی بادی گیرنده در روش ای مختلف کراس مچ

 

انواع روش های کراس مچ

یکی از این روش ها سایتوتوکسیسیتی با واسطه کمپلمان(CDC) است. زمانی که تیتر آنتی بادی علیه دهنده بالا باشد، این آنتی بادی ها به سول متصل شده و قادر به فعالسازی کمپلمان خواهند بود، سلول از بین رفته و رنگ وارد سلول می شود (a). در روش سایتوتوکسیسیتی با  Anti human globlin (AHG) یا AHG-CDC، تیتر پایین آنتی بادی در سطح سلول قادر به فعالسازی کمپلمان نبوده، در نتیجه اضافه کردن  AHG موجب افزایش دانسیته آنتی بادی های سطح سلول و در نتیجه فعالسازی کمپلمان خواهد شد (b). در روش فلوسیتومتری(FCXM)، آنتی بادی های اختصاصی علیه دهنده به سلول متصل شده و سپس یک آنتی بادی ثانویه علیه IgG انسانی اضافه می شود. به این ترتیب حتی مقادیر بسیار کم آنتی بادی نیز تشخیص داده می شود (c).

 

شکل 4. مقایسه انواع روش های کراس مچ. a) سایتوتوکسیسیته با واسطه کمپلمان، b) سایتوتوکسیسیته با واسطه کمپلمان و استفاده از AHG c) سایتوتوکسیسیته با استفاده از فلوسیتومتری

 

محدودیت های کراس مچ سایتوتوکسیک مشابه روش PRA است. در این روش احتمال عدم تشخیص تیترهای پایین آنتی بادی و در نتیجه گزارش منفی کاذب وجود دارد. به علاوه احتمال تشخیص آنتی بادیIgG  علیه آنتی ژن های غیر HLA، آنتی بادی IgM علیه آنتی ژن های HLA و غیر HLA وجود دارد که منجر به نتایج مثبت کاذب خواهند شد. البته مشکل حضور IgM را می توان با اضافه کردن dithiothriotol حل کرد.

 

روش کراس مچ فلوسیتومتریک

روش کراس مچ فلوسایتومتریک (FCXM)، با روش کراس مچ سایتوتوکسیک متفاوت است که در آن تنها آنتی بادی های علیه دهنده صرف نظر از توانایی آن ها برای تثبیت کمپلمان تشخیص داده می شوند. در FCXM تنها حضور یا عدم حضور آنتی بادی IgG در سطح لنفوسیت های دهنده مشخص می شود.

در این روش سرم گیرنده با لنفوسیت های دهنده انکوبه شده و سپس با یک آنتی بادی ضد IgG نشاندار شده با رنگ فلورسنت رنگ آمیزی می شوند. این رنگ تنها در صورتی باقی می ماند که آنتی بادی موجود در سرم گیرنده به سطح سلول دهنده متصل شده باشد. در این روش امکان اضافه کردن آنتی بادی های اختصاصی سلول T و B با رنگ های فلورسنت دیگر وجود دارد که به این ترتیب آنتی بادی های علیه سلول های T یا B دهنده از یکدیگر قابل تفکیک هستند. نتایج FCXM نیمه کمی هستند، با این حال بسیار قابل اعتماد تر از نتایج کراس مچ سایتوتوکسیک هستند. البته تفاوت های زیادی بین روش FCXM مورد استفاده و تفسیر نتایج در آزمایشگاه های مختلف وجود دارد. در برخی از انواع FCXM امکان اندازه گیری همزمان آنتی بادی های متصل شونده و غیر متصل شونده به کمپلمان با استفاده از تکنیک های رنگ آمیزی مناسب وجود دارد. علیرغم حساسیت بیشتر این تست برای آنتی بادی های متصل شونده به کمپلمان نسبت به سایر تست های سایتوتوکسیک وابسته به کمپلمان، نقش این تست در ارزیابی خطر رد پیوند بیماران به خوبی شناخته نشده است.


نویسندگان

دکتر شیرین کوهپایه ، واحد تحقیق و توسعه آزمایشگاه پاتوبیولوژی و ژنتیک اریترون

دسته بندی مطالب

غربالگری سلامت جنین غربالگری سلامت نوزادان غربالگری و پیشگیری از سرطان خدمات تشخیص پزشکی و بالینی خدمات ایمونولوژی و ایمونوفلورسانس خدمات پاتولوژی و سیتو پاتولوژی آموزش های همگانی و تخصصی همکاران و متخصصین آزمایشگاهی

تماس با ما


اریترون یک آزمایشگاه تخصصی است که از راه های مختلف می‌توانید با آن در تماس باشید و پرسش ها و مشکلات خود را به آسانی با متخصصین ما در میان بگذارید.

 

ساعت کار آزمایشگاه از 06:30 صبح الی 10 شب به طور یکسره و روزهای تعطیل از 7 صبح الی 2 بعد از ظهر

اصفهان / خیابان شیخ صدوق شمالی / خیابان شیخ مفید غربی

جواب آزمایش خود را به آسانی از طریق ربات تلگرامی به آدرس [email protected] دریافت نمایید.

شماره تماس : 2-36633621 - 031

شماره فکس: 89784728- 021

[email protected]

کد پستی : 76351-81647