آزمایش HLA به روش سرولوژیک

| تعداد بازدید : 41

 کمپلکس سازگاری اصلی بافتی(MHC) Major Histocompatibility Complex به عنوان یک گروه از ژن‌های کاملاً بهم چسبیده‌ای که آنتی‌ژن‌های HLA را کد می‌کنند و آنتی‌ژن‌های اصلی سازگاری بافتی هستند وجود دارند. این سیستم در پیوند عضو، سازگاری بین دهنده و گیرنده را تعیین می‌کند.  آنتی‌ژن HLA پپتیدهای خارجی را به دام انداخته و به گیرنده‌های سلول T عرضه می‌کند. بیش از 200 ژن در کمپلکس HLA بر روی کروموزوم 6 حضور دارند که بیش از 40 آنتی‌ژن لوکوسیتی را کد می‌کنند.

آزمایش HLA  به روش سرولوژیک

تاریخچه آزمایش HLA

 تاریخچه آزمایش تعیین سازگاری بافتی به زمانی بر می گردد که دانشمندان آنتی بادی های آگلوتینه کننده لکوسیتی را در سرم افرادی که تزریق خون مکرر داشته‌ یا بیمارانی که کلیه دریافت کرده‌اند و یا زنانی که زایمان‌های مکرر (multiparous) داشته‌اند مشاهده کردند. این مولکول ها که به نام آنتی ژن های سازگاری اصلی یا MHC خوانده می شوند در انسان با جستجوی مولکوهای سطحی سلول در یک فرد، که در فرد دیگر به عنوان بیگانه محسوب می‌شدند، کشف شد. این عمل زمانی امکان‌پذیر شد که مشخص شد افراد با تزریق خون مکرر یا سابقه پیوند قبلی و یا زایمان مکرر حاوی آنتی‌بادی‌هایی در گردش خونشان هستند که سلول‌های پدری یا دهنده خون یا پیوند را شناسایی می‌کنند. پروتئین‌هایی که توسط این آنتی‌بادی‌ها شناسایی می‌شوند، آنتی‌ژن‌‌های لکوسیتی انسان(Human leukocyte antigens) (HLA) نامیده شدند. مطالعات بعدی نشان داد که همانند موش‌ها، توارث الل‌های خاص HLA ، نقش اصلی را در رد یا قبول پیوند دارد.

مولکول های HLA به دو دسته کلی کلاس I و II تقسیم بندی می شوند. مولکول های کلاس I  (A, B, C) در سطح اکثر سلول های هسته دار و پلاکت ها وجود دارند و مولکول های کلاس (DR, DP, DQ)II   در سطح سلول های B ، سلول های عرضه کننده آنتی ژن مانند سلول‌های دندریتیک، ماکروفاژها ر و سلولهای اندوتلیال مشاهده می‌شوند و در سیستم ایمنی، برای تشخیص خودی از غیر خودی، نقش اساسی ایفا می کنند. آنتی ژن های HLA، به عنوان حامل برای عرضه پپتیدها درسطح سلول استفاده می شوند.. از طریق بر هم کنش HLA و گیرنده سلول T شاخص های غیر خودی مورد شناسایی قرار گرفته و  تحریک پاسخ ایمنی مناسب انجام می گیرد. جایگاه ژنی HLA انسان در موقعیت P21.3 روی بازوی کوتاه کروموزوم ۶ و در محلی به نام کمپلکس اصلی سازگاری نسجی MHC قرار دارد که ظرفیتی معادل ۴ مگا باز دارد. ژنهایHLA  در هر فرد بصورت هم غالب بروز می کنند، به عبارتی هر فرد دو آلل از چندین آلل HLA بسیار پلی مورفیک به ارث رسیده از پدر و مادر را به صورت همزمان بر سطح سلولهای خود بروز می دهد.

سیستم HLA به عنوان یک مارکر ایمونولوژیک در انگشت نگاری DNA ، تعیین هویت، تایید ابوت، سازگاری دهنده و گیرنده پیوند و ترانسفوزیون پلاکت سازگار استفاده می شود. به علاوه مشخص شده است که بسیاری از آنتی‌ژن‌های HLA با بیماری‌های خود ایمنی نظیر اسپوندیلیت آنکیلوزان و یا بیماری های آرتروئید از جمله سندرم رایتر، بیماری سلیاک، گلومرولونفریت غشایی ایدیوپاتیک، سندرم گودپاسچر و پمفیگوس ولگاریس ارتباط دارند.

تشخیص HLA به روش سرولوژیک

روش های تعیین HLA

شناسایی آنتی ژنهای HLA کلاس I

آزمایش میکروسایتوتوکسی سیتی  (Microcytotoxicity test)

اولین روش استفاده شده برای تعیین پلی مورفیسم  HLA، لنفوسایتوتوکسیسیتی وابسته به کمپلمان بود که توسط Terasaki و Patel  گسترش یافت. در این آزمایش که روشی سرولوژیک می باشد، آنتی سرمهای حاوی آنتی بادی مشخص ضد HLA با لنفوسیت های خون محیطی مجاور گردیده و بعد از گذشت زمان انکوباسیون، کمپلما ن سرم خرگوش به آن اضافه گردیده و مجددا انکوبه می گردد. در صورتی که در سطح لنفوسیت ها آنتی ژنی که آنتی بادی آن در سرم موجود است، وجود داشته باشد، کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی تشکیل شده و سپس کمپلمان اضافه شده فعال می شود. در اثر فعال شدن کمپلمان در غشای سلولی منافذ کوچکی ایجاد می گردد و لیز سلولی اتفاق می افتد. این سلول های لیز شده با استفاده از رنگ حیاتی ( ائوزین، تریپان بلو) در زیر میکروسکوپ دارای فاز کنتراست قابل مشاهده و شمارش می باشند.

 میکروسکوپ دارای فاز کنتراست

شناسایی آنتی ژنهای HLAکلاس II

در این موارد چون مولکول های کلاس II بر روی لنفوسیت های B هستند باید لنفوسیت های B و T را از یکدیگر جدا کرد. علاوه بر این آنتی سرم های B نیز باید خالص باشند که برای این امر از پلاکت ها برای جذب آنتی سرم ها استفاده می شود. اساس آزمایش مانندHLA-A, B, C  است و فقط زمان های انکوباسیون طولانی تری دارند. لازم به ذکر است که کارایی روش سرولوژیک برای شناسایی آنتی ژن های کلاس II و به ویژه HLA-DR قابل قبول نیست و برای این مولکول می توان از آزمایش کشت مخلوط لکوسیتی (MLC)استفاده نمود.

 

شناسایی آنتی ژنهای HLA کلاس Iد(HLA Class I)

 

آزمایش کشت مخلوط لکوسیتی  (Mixed Lymphocyte Culture, MLC)

در این آزمایش قرابت آنتی ژنهای کلاس II و به عبارت دقیق تر تشابه یا اختلاف آنتی ژنهای HLA–DR, DQ, DP لنفوسیت های دو فرد مورد بررسی قرار می گیرد. در این آزمایش چنانچه لنفوسیت های دو نفر را که از نظر آنتی ژنهای کلاس II با هم متفاوتند با یکدیگر مجاور کنند، لنفوسیت های هر فرد در مقابل لنفوسیت های دیگری تحریک شده و تکثیر می شود.  برای سهولت درک واکنش به طور معمول یک نمونه را تحت تأثیر اشعه یا برخی مواد، غیر فعال نموده (به عنوان محرک)، و دیگری را به عنوان پاسخ دهنده مورد استفاده قرار می دهند؛ به این آزمایش، MLR یک طرفه می گویند. غالباً نوع آنتی ژن سلول محرک مشخص است و از روی آن تفاوت یا تشابه لنفوسیت های پاسخ دهنده را معین می کنند. بدین ترتیب که اگر آنتی ژنهای هر دو نوع یکسان باشند سلولهای پاسخ دهنده تحریک نمی شوند، اما اگر اختلاف داشته باشند متعاقب آن تکثیر لنفوسیت های پاسخ دهنده به وقوع می پیوندد. درجه تکثیر لنفوسیت ها را می توان با توانایی این سلول ها در جذب تایمیدین رادیواکتیو در DNA مورد سنجش قرار داد. مزیت این روش در این است که میزان فعالیت سلولهای TH را در پاسخ به آنتی ژن های MHC کلاس دو، بهتر نشان می دهد و از معایب آن می توان به طولانی بودن زمان انجام آزمایش اشاره کرد.

 

HLA-B27

HLA-B27  در 3 تا 4 درصد از آفریقایی‌ها، 6 تا 8 درصد از قفقازی‌ها و 1 درصد از آسیایی‌ها وجود دارد. HLA-B27 یک ارتباط قوی با مبتلایان به اسیوندیلیت آنکیلوزان(AS; Marie-Strumpell disease) دارد ولی در همه آنها دیده نمی‌شود، بلکه  چیزی درحدود 90% بیماران دارای این مولکول هستند. یک بیمار دارای HLA-B27 که یافته‌های بالینی و رادیولوژیک آن مطابق با AS باشد، احتمال اینکه بیماری را داشته باشد یا مبتلا شود 100 برابر فردی است که HLA-B27  منفی باشد. بهرحال این آنتی‌ژن علت بیماری محسوب نمی شود چرا که 7-5% از افراد طبیعی هم  دارای HLA-B27 هستند به همین دلیل از این تست نباید به عنوان روش غربالگری جهت AS استفاده شود. آنتی‌ژن HLA-B27 ارتباط کم ‌تری با سندرم رایترز، آرتریت‌ پسوریاتیک،  آرتریت روماتوئید جوانان(JRA) و سایر آرتریت‌های به دنبال عفونت با ارگانیسم‌های گرم منفی دارد. همچنین ارتباط HLA-B27 با فقدان مادرزادی اجزاء C2 و C4 کمپلمان، هیپرپلازی آدرنال و بیماری التهابی روده هم دیده شده‌ استارزیابی اسپوندیلوآرتریت یا اسپوندیلیت آنکیلوزان ،JRA، سندرم رایترز، آرتریت پسوریاتیک و یووئیت قدامی  از کاربردهای بالینی رزیابی HLA-B27 می باشد.

 

منابع:

         Vartdal F, Gaudernack G, Funderud S, Bratlie A, Lea T, Ugelstad J, et al. HLA class I and II typing using cells positively selected from blood by immunomagnetic isolation‐a fast and reliable technique. HLA. 1986;28(5):301-12.

        Kaukinen K, Partanen J, Mäki M, Collin P. HLA-DQ typing in the diagnosis of celiac disease. The American journal of gastroenterology. 2002;97(3):695-9.

Abbas A, Lichtman A: cellular and molecular Immunology, fifth edition, 20


نویسندگان

دکتر الهام عبدالهی، دکتر شیرین کوهپایه ، دپارتمان ایمونولوژی و ایمونوفلورسانس آزمایشگاه اریترون

تماس با ما


اریترون یک آزمایشگاه تخصصی است که از راه های مختلف می‌توانید با آن در تماس باشید و پرسش ها و مشکلات خود را به آسانی با متخصصین ما در میان بگذارید.

 

ساعت کار آزمایشگاه از 06:30 صبح الی 10 شب به طور یکسره و روزهای تعطیل از 7 صبح الی 2 بعد از ظهر

اصفهان / خیابان شیخ صدوق شمالی / خیابان شیخ مفید غربی

جواب آزمایش خود را به آسانی از طریق ربات تلگرامی به آدرس [email protected] دریافت نمایید.

شماره تماس : 2-36633621 - 031

شماره فکس: 89784728- 021

[email protected]

کد پستی : 76351-81647