تنظیم بیان miRNAها در سرطان

دو روش برای تنظیم بیان miRNAها در سرطان وجود دارد، روش اول مهار بیان miRNAهای انکوژن با استفاده ازSyntetic miRNAs-anti  یا miRNA antagonists و یا  Loked acide nucleic(LANs) برای مثال استفاده از الیگونوکلئوتیدهای آنتی سنس (sense Anti) که توالی آن ها مکمل miRNA انکوژن بالغ درون بدن است، روش دوم در مورد miRNAهای تومور ساپرسور انجام می گیرد که در سرطان های مختلف کاهش بیان پیدا می کنند، در این مورد درمان با بازگرداندن بیان این miRNAها به حالت نرمال انجام می گیرد، برای این منظور از روش miRNA therapy replacement استفاده می شود.

استفاده از microRNA در درمان سرطان

اخیراً در درمان سرطان ها از خود  AMO(anti-microRNA) یاmicroRNA (oligodeoxyribonucleotide) antisense ها به تنهایی یا همراه با داروها، شیمی درمانی و رادیوتراپی استفاده شده است. microRNA ها پایدارتر از mRNA ها می باشند. یک microRNA می تواند صدها هدف ژنی داشته باشد و در اکثر مایعات بدن microRNA ها یافت می شود که این مزیت ها دانشمندان را بر آن داشت که از microRNA  در درمان استفاده کنند.

 درمان سرطان با  miRNA replacement therapy

در گذشته عمل درمان با بازگردانی ژن پروتئین های تومور ساپرسور در بافت سرطانی توسط ژن درمانی بررسی شده است، ولی این روش کاربردی نشد، زیرا تومورساپرسورها به ژن های کد کننده پروتئین محدود می شد، این ژن درمانی معمولا شامل انتقال یک پلاسمید DNA نسبتا بزرگ و یا یک وکتور ویروسی کد کننده پروتئین مورد نظر بود که اغلب اندازه وکتور و یا انتقال ناکارآمد به بافت هدف باعث ناموفق بودن این تکنیک شد. بنابراین با وجود شواهد قوی و علمی، برای درمان سرطان توسط تکنیک ژن درمانی این روش کنار گذاشته شد .باکشف miRNAها و شناسایی عملکرد آن ها فرصت جدیدی فراهم شد، زیرا این مولکول ها به طور قابل ملاحظه ای کوچکتر از پروتئین ها هستند و می توان ازتکنیک های انتقال siRNA نیز برای انتقال miRNA به سلول هدف استفاده کرد.در سال 2008 Kerscher و همکارانش برای اولین بار ثابت کردند که بازگرداندن سطح بیان  Let-7باعث مهار سرطان ریه در موش های مدل سرطان ریه می شود. این تحقیق نشان داد که Let-7 در سرطان ریه عملکرد تومورساپرسوری دارد، وهمچنین نشان داد که Let-7 می تواند یک پتانسیل درمانی در درمان سرطان ریه باشد.این یافته ها نشان می دهد، تکنیک بازگردانی بیان miRNA های تومورساپرسور در سرطان می تواند به عنوان یک هدف درمانی باشد، این روش درمانی به سه طریق انجام می گیرد.

1.انتقال miRNA mimic

2.انتقال ژن miRNA توسط پلاسمید DNA به داخل سلول توموری

3.استفاده از مولکول های کوچک که باعث بازگردانی تغییرات اپی ژنتیک در miRNA ها می شوند.

روش های ارائه MICRO RNA به سلول سرطانی ( Delivery)

یکی از چالش های اولیه در درمان بر پایه miRNAها مسئله delivery آن ها است.به طور کلی  delivery ایده ال سیستم است که:

 miRNA.1 را از تخریب در گردش خون محافظت کند.

miRNA.2را به سلول های هدف تحویل دهد و مانع از تحویل آن به سلول های دیگر شود.

3. جذب سلولی miRNA را تسهیل کند.

4. باعث تحریک سیستم ایمنی برعلیه وکتور نشود.

5. دارای سازگاری زیستی وتجزیه پذیر biodegradable & biocompatible باشد.

 برای delivery miRNA از دو نوع وکتور می توان استفاده کرد: وکتورهای ویروسی و وکتورهای غیرویروسی. وکتورهای ویروسی در حالتin vivo  باعث تحریک سیستم ایمنی میزبان می شوند به همین دلیل تلاش های قابل توجهی برای توسعه استفاده از حامل های غیرویروسی انجام گرفته است .

وکتورهای غیر ویروسی vector viral-non در پنج گروه اصلی جای می گیرند:

1. نانو کریرهای لیپیدی Lipid-based nanocarriers

2.وکتورهای پلیمری polymeric vector

Dendrimer-based vector (polyamidoamine dendrimers) .3

Amphilic star-branched copolymer .4

Inorganic materials .5

روش های درمانی با microRNA

1-استفاده از ژن پیش سـاز مربـوط بـه microRNA :

در این روش ژن مربوط بـه microRNA را در یـک وکتـور بیان که می تواند ویروسی یا پلاسمید باشد وارد مـی کننـد. در طراحی وکتور مسائلی مانند پروموتور و طول قطعـه ژنـی را مد نظر قرار می دهند.از لنتی ویرال هـا و آدنـوویرال ها هم برای سلول های تمایز یافته که تقسیم نمی شـوند و هم برای سلول های در حال تقسیم استفاده می کنند. ولـی آدنوویرال ها چون د اخل ژنـوم وارد نمـی شـوند، در سـلول های در حال تقسیم رفته رفته محو می شوند. مـشکل اصلی استفاده از وکتورهای بیان در in vivo  این است کـه سیستم ایمنی میزبان اکثراً آن ها را حذف می کند. در یک آزمایشی که در آن با بالا بردن بیان k-ras در مـوش به صورت شرطی سرطان ریه ایجاد کرده بودند معلـوم شـد که تزریق داخـل بینـی آدنوویروسـی بیـان کننـده  let-7aتومورزایی را کاهش می دهد.

2- استفاده از :mimic microRNA

در این روش از microRNA  که نقش tsmicroRNA را دارد، و معمـولاً به صورت دو رشته ای که محصول Dicer است به داخـل سلول انتقال می دهند. در سـال 2010 نـانو ذره LPH که بـه یـک آنتـی بـادی تـک رشـته ای ضـد توموری همراه شد، توانست به صورت هدف دار mir-34a  را به سلول های ملانوما انتقال دهد.  

3-استفاده از (anti-microRNA antisense oligodeoxyribonucleotide)AMO

 در مورد Oncomir از AMOاستفاده می کنند، ولی به دلیـل ایـنکه AMOها تک رشته هستند و تحت تاثیر نوکلئازهـای داخل سلولی قرار می گیرند بـا اعمـال تغییـرات شـیمیایی پایداری این رشته ها را افزایش می دهند.

•  LNA : در   LNAانتهای َ 2ریبوز با انتهای َ 4وصل می شود. AMO که حاوی LNA-antimiR-122  است در مـوش باعـث پـایین آمـدن  miR-122شـده و چـون  miR-122باعث افزایش تولید کلسترول در خون می شود اســتفاده از  LNA-antimiR-122کلــسترول خــون را کاهش می دهد.

•  AMOمتصل به کلسترول: اتـصال بـه کلـسترول باعث افزایش نفوذ پذیری  AMOبه داخل سلول هـا مـی شود.

•  Morpholinos : شــکل شــماره 2 نــشان دهنــده ســاختار  Morpholinos اســـت در آن ریبـــوزهـــا بـــا phosphorodiamidate  و فــسفات بــاMorpholine  جایگزین شـده اسـت.  Morpholinosپایـداری بـالاتری نسبت به نوکلئاز داخل سلولی دارد.

شکل شماره 1ساختار. Morpholino

PNAها: شکل شماره 2ساختار PNAs را نشان می دهد که در آن ریبوز و فسفات با glycine N-(2-aminoethyl)جایگزین شده اند.  PNAsمقاوم به پروتئاز و نوکلئازها و تغییر  PH است.

شکل شماره 2 ساختار PNAs

به دام انـدازی :microRNA در ایـن روش با اسـتفاده از mRNA که حاوی چنـدین مـکان اتـصال به    microRNA  اسـت مـانـع اثـر  microRNAبر اهداف ژنی خـود می شــوند.(شکل شماره3 )در این روش mRNA مـی تـواند به صورت پایدار در سـلول های مورد نـظر داخـل وکـتور بیان شـده و محصولات ژن های هدف  microRNAرا با اتصال به خود microRNA افزایش دهد، این mRNA را sponge miRNA  نامگذاری کرده اند.

شکل شماره3 به دام اندازی.microRNA

روش های شناسایی miRNA ها

 میکروآرایه miRNA

میکروآرایه جزء موثرترین روش های مورد استفاده برای شناسایی miRNA ها است. این تکنولوژی امکان آنالیز هم زمان هزاران miRNA را در طی یک آزمایش فراهم می‌کند. مرحله اول در میکروآرایه miRNA ،خالص سازی  RNA یا miRNA از سلول ها یا بافت است. پروتکل های بسیاری به منظور استخراج RNA با کیفیت بالا، توسعه یافته اند. اگر چه امکان استفاده از کل RNA برای آنالیز میکرواریه وجود دارد، از آن جایی که miRNA ها تنها در حدود 0.01درصد از کل RNA ها را تشکیل می دهند، جداسازی و استخراج miRNA ها دقت را بالا می برد. سپس miRNA های بالغ می توانند به صورت مستقیم با استفاده از RNA ligase T4  با اتصال یک یا دو نوکلئوتید نشان دار شده با فلوروفور به انتهای ′3 miRNA ،نشان دار شوند. در شناسایی miRNA ها با استفاده از آنالیز میکرواریه، طراحی پروب مناسب بسیار ضروری است. در همه میکرواریه های که جهت بیان ژن هستند، الیگونوکلئوتید های سنتزی و یا قطعات cDNA که دارای اختصاصیت و تمایل بالینی برای هر رونوشت هستند، به کار می روند. از آن جایی که miRNA ها خیلی کوتاه هستند(23 – 19nt ) طراحی پروب برای شناسایی آن ها با محدودیت هایی همراه است و براساس توالی miRNA دمای ذوب آن ها بین 45 C°  و74 C° در تغییر است. از آن جایی که میل ترکیبی miRNA های مختلف متفاوت است، اصولا نباید برای شرایط کمی به کار رود ولی بهتر است برای مشخص کردن تغییرات نسبی بیان بین دو حالت مانند بیمار در برابر سالم و یا مشخص کردن حضور یک miRNA به کار رود. به هر حال بر اساس ویژگی های شیمی فیزیک یک miRNA ،افزایش و یا کاهش طول یک پروب می تواند منجر به تعادل بهتر در دماهای ذوب پروب های miRNA  شده و در نتیجه باعث می شود که آنالیز دقیق تری صورت بگیرد.  ́

اولین مرحله برای انجام آنالیز میکروآرایه، خالص سازی miRNAهای بالغ از سلول ها و یا بافت های تازه و یا فیکس شده است miRNA ها بعد از استخراج با استفاده از یک رنگ، نشاندار شده و سپس مستقیما با آرایه های دارای پروب های اختصاصی برای miRNA ها هیبرید می شوند. قطعات دو رشته ای حاصل می توانند به آسانی شناسایی شوند. سپس از miRNA ها و یا tRNA برای نرمال سازی، تایید و مقایسه داده ها استفاده می شود. همچنین آنالیز PCR-qRT و نورترن بالت می تواند به منظور بررسی داده های میکروآرایه به کار رود.

 بسیاری از تغییرات می توانند پایداری دوپلکس miRNA و پروب را افزایش دهند. تغییرات methyl-O′-2 در نوکلئوتیدها تمایل هیبریداسیون را افزایش می دهد. علاوه بر این به کار گیری LNA ها بسته به جایگاه بخش LNA در الیگونوکلئوتید، به ازای هر مونومر LNA ،دمای ذوب را بین 5 C° تا 8 C° بالا می برد و می تواند تمایل اتصال پروب به دام افتاده را افزایش دهد. اگر چه آنالیز میکروآرایه نیازمند به بهینه سازی است، ابزاری مفید برای بررسی بیان یا بیان نابجای miRNA ها در بافت مورد نظر است. به هر حال اطلاعات حاصل از میکرواریه باید با استفاده از روش های تشخیصی دیگر، تایید شود.

شکل4 :آنالیز میکروآرایه miRNA ها

  روش  Real-Time PCR

اگرچه روش های پروفایل بیانی برای ایجاد دید کلی در مورد حضور و یا تنظیم miRNA ها مفید هستند، اما لازم است دقت این داده ها به وسیله روش های خاص miRNA ،تایید شوند. رایج ترین تکنیک برای تشخیص miRNAها، آنالیز Real-Time PCR است. واکنشreal-time، miRNAها با رونویسی معکوس RNA  به cDNA ،آغاز می شود. طول کوتاه miRNA ها، فقدان دم پلی A و این واقعیت که توالی miRNA بالغ در pre-miRNA  وpri-miRNA  نیز وجود دارد، چالش های متعددی را برای رونویسی معکوس ایجاد می کند. با این حال امروزه از دو روش متفاوت برای رونویسی معکوس استفاده می شود: رونویسی معکوس اختصاصی و عمومی miRNA ها . در روش اول، هر miRNA به وسیله پرایمرهای  اختصاصی به صورت معکوس رونویسی می شوند. پرایمرهای ساقه ولوپ دارای سه بخش مختلف اند: بخش تک رشته ای کوتاه، که مکمل توالی شناخته شده در انتهای ′3 است، قسمت دو رشته ای ساقه و لوپ که توالی عمومی متصل شونده به پرایمر است cDNA .حاصل سپس به وسیله یک پرایمر اختصاصی miRNA و یک پرایمر عمومی، برای PCR کمی به کار می رود. طراحی پرایمرهای ساقه ولوپ بسیار سخت است ولی ساختار آن ها اتصال پرایمر به  miRNA-pre و miRNA-pri را کاهش داده و در نتیجه اختصاصیت روش را افزایش می دهند. در روش دوم یک توالی عمومی به همه miRNA ها اضافه شده و سپس  ioimiRNA به وسیله پرایمرهای عمومی به صورت معکوس رونویسی می شود. این روش بسیار کاربرد دارد به خصوص زمانی که به آنالیز چندین miRNA  مختلف با کمک مواد اولیه محدود نیاز باشد. به انتهای همه miRNA ها با استفاده از پلی A پلیمراز، دم پلی A اضافه می شود. هر پرایمر شامل یک توالی الیگو dT و یک توالی مشترک متصل شده به پرایمر در انتهای  ′5 است و برای آغاز رونویسی معکوس و تکثیر توالی های هدف در واکنش qPCR به کار می رود. اگرچه روش های متعددی برای رونویسی معکوس یک miRNA  وجود دارد، اختصاصیت و حساسیت سنجش هایreal-time  وابسته به طراحی پرایمرهای اختصاصی miRNA است، زیرا تمایل اتصال یک پرایمرکه به وسیله توالی و میزانCG،miRNA  مشخص می شود، تعیین کننده دمای ذوب توالی مکمل پرایمر اختصاصیmiRNA  است.

شکل5 :رونویسی معکوس miRNA

در اولین روش هر miRNA به وسیله پرایمرهای ساقه لوپ که به صورت اختصاصی عمل می کنند رونویسی معکوس می شوند. این پرایمرها به فرمی طراحی شده اند که دارای سه بخش هستند: یک ناحیه تک رشته ای کوتاه که مکمل توالی شناخته شده در انتهای ′3 ،  miRNA است، قسمت دو رشته ای )ساقه( و لوپ که توالی عمومی متصل شونده به پرایمر است. cDNA سپس به عنوان الگو، به وسیله یک پرایمر اختصاصی miRNA و یک پرایمر عمومی، برای PCR کمی به کار می رود ( B. در روش دوم یک توالی عمومی به همه miRNA ها اضافه شده و سپس miRNA به وسیله پرایمرهای عمومی به صورت معکوس رونویسی می شود. این روش بسیار کاربرد دارد به خصوص زمانی که به آنالیز چندین miRNA مختلف با کمک مواد اولیه محدود نیاز باشد. به انتهای همه miRNA ها با استفاده از پلی A پلیمراز، دم پلی A اضافه می شود. هر پرایمر شامل یک توالی الیگو dT و یک توالی مشترک متصل شده به پرایمر در انتهای ′5 است و برای آغاز رونویسی معکوس و تکثیر توالی های هدف در واکنش qPCR به کار می رود.

منابع:

WEIQI, T., Expression and roles of microRNAs in cell cycle. 2009

issels, U., et al., Combined characterization of microRNA and mRNA profiles delineates early differentiation pathways of CD133+ and CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem Cells, 2011. 29(5): p. 847-857

 arina D. omer , m.M.J., The chicken or the Egg:Micro RNA-mediated regulation of mRNA translation or mRNA stability. Molecular cell, 2009. 35(6): p. 739-740

Iorio, M.V. and C.M. Croce, microRNA involvement in human cancer. Carcinogenesis, 2012. 33(6): p. 1126-1133

 Zhang, B., et al., microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Developmental biology, 2007. 302(1): p. 1-12

Ebert, M.S. and P.A. Sharp, Roles for microRNAs in conferring robustness to biological processes. Cell, 2012. 149(3): p. 515-524