در طی دو دهه اخیر روش های مختلفی شامل اندازه گیری مارکرهای بیوشیمیایی و پارامترهای سونوگرافی و همچنین ترکیب این دو با هم برای انجام غربالگری های سلامت جنین ابداع شده است٬ اما به علت اشکالات موجود در این روش ها ٬دانشمندان همیشه به دنبال روش هایی بهتر بودند.بزرگترین ایراد در روش های سنتی غربالگری٬درصد بالای نتایج مثبت و منفی کاذب و در تست های تاییدی نیز احتمال سقط جنین به علت تهاجمی بودن روش نمونه گیری وجود دارد. از دیگر نکات منفی روش های غربالگری رایج می توان به چندمرحله ای بودن پروسه آزمایش ٬نتایج غیر اختصاصی و گاهی گیج کننده و غیرقابل تصمیم گیری و در نتیجه افزایش ریسک استفاده از روش های تهاجمی اشاره کرد. در سال 1997 دانشمندان به وجود DNA جنین در خون مادر پی بردند. این کشف مهم که با ردیابی قسمت هایی از کروموزوم Y جنینی در سرم مادر توسط Dennis Lo صورت گرفت٬اساسی شد برای ظهور روش های غیرتهاجمی تشخیص آنوپلوئیدی ها در دوران بارداری. اصول این روش بر پایه اندازه گیری DNA آزاد در پلاسما است که از سلول های جفت آزاد می شود.صاحب نظران این کشف را یک انقلاب در علوم تشخیصی می دانند و پیش بینی می کنند که در آینده نزدیک جایگزین تست های رایج غربالگری و تشخیص دوران بارداری گردد.

آزمایش غربالگری Harmony نوعی آنالیز Cell Free DNA (NIPT) جنین در خون مادر می باشد که در روش پیشرفته آن از تکنولوﮊیDANSR؛Digital Analysis of Selected Regions برای بررسی و تشخیص DNA جنین استفاده می کند. روش های NIPT دیگر از روش rMPS ; random Massively Parallel Sequencing بهره می گیرند. تکنولوﮊی DANSR ­ Harmonyپنج برابر مثبت کاذب کمتر نسبت به دیگر روش های NIPT دارد. به همین دلیل خانم های بارداری که به دلایل بالینی لازم است هپارین در طول بارداری دریافت کنند تنها روش غربالگری NIPT مناسب برای آنها آزمایش هارمونی است . هپارین روی محتویات نوکلوتیدی GC جنین تاثیر می گذارد و باعث GC­ Bias می گردد. که چنانچه در این موارد آنالیز DNA با NIPT معمولی با روش rMPS انجام شود نتایج غیر واقعی به دنبال دارد.

آزمایش های NIPT و هارمونی برای تشخیص و غربالگری اختلالات ﮊنتیکی میکرودلیشن و موزائیک کاربردی ندارد.

انجام آزمایش هارمونی هیچ گاه خانم باردار را از انجام سونوگرافی های NT&NB و سونوگرافی آنومالی اسکن (تفصیلی)بی نیاز نمی کند.

*آزمایش هارمونی برای غربالگری باز بودن کانال نخاعی (NTDs)کاربردی ندارد بنابراین لازم است خانم باردار در هفته های 15 تا 17 بارداری آزمایش M.AFP برای غربالگری NTDsرا انجام دهد.

* در حدود 2 درصد نتایج هارمونی که آزمایش NIPT و آنالیز Cell free DNA آنها با تفسیرهای غیرقابل گزارش و غیرقابل تفسیر آماده می شود٬باید به عنوان آزمایش پرخطر تلقی شود و مشاوره های ﮊنتیک و اقدامات سونوگرافی تکمیلی را با نظر پزشک انجام دهند.

*اقدامات ختم بارداری هیچگاه بر مبنای نتایج و تفسیر آزمایش های NIPT انجام نمی شود.

*آزمایش هارمونی برای بارداری های سه قلو به بالا کاربردی ندارد.

آزمایش هارمونی آزمایشی غربالگری است و هیچگاه جایگزین آمنیوسنتز به عنوان یک روش تشخیصی نیست و از تعداد بسیار زیادی آمنیوسنتزهای غیرضروری که نتیجه مثبت کاذب آزمایش های غربالگری معمول می باشد،جلوگیری خواهد کرد.

*آزمایش هارمونی تعیین جنسیت بارداری های دوقلو را انجام نمی دهد.

*افزایش وزن مادر و نمونه گیری زودتر از هفته دهم بارداری نرخ تشخیص آزمایش هارمونی را کاهش می دهد.

*نتایج مثبت آزمایش هارمونی باید با روش های تشخیصی تایید شود.آمار نشان می دهد در 99.8 درصد موارد نتایج آزمایش هارمونی با نتایج آمنیوسنتز تطابق داشته است.

*آزمایش هارمونی برای غربالگری دوقلوهایی که یک قل آن از بین رفته است (VTS)مناسب نیست

پاسخ آزمایش Harmony. NIPT با سه عنوان گزارش می‌شود:

‏1. High Risk

‏2. Low Risk

‏3. Redraw Request (RR) or inconclusive result

• حدود 3/2 تا 3/5 درصد نتایج NIPT  نیاز به تکرار نمونه‌گیری  دارند (RR).

• از تعداد کل خانم‌های بارداری که نیاز به تکرار نمونه‌گیری دارند (RR) پس از تکرار آزمایش حدود 51 درصد نتیجه Low Risk، 8درصد High Risk و 41درصد برای بار دوم نیاز به تکرار نمونه‌گیری مجدد پیدا می‌کنند.

• با وجود تکرار نمونه‌گیری 2 تا 3 بار حدود 5/1 درصد از کل خانم‌های باردار نتیجه NIPT آن‌ها غیر قابل گزارش یا (I.R) خواهد بود.

• از کل نتایج غیر قابل گزارش (I.R) حدود 8/13 درصد جنین مبتلا با ناهنجاری‌های کروموزومی تریپلوئیدی است (T21، T13،T18،Tzo، 45XO و ...).

• شایع‌ترین علل نتایج غیر قابل گزارش (I.R) در آزمایش غربالگری NIPT عبارتند از:

1- جدا نشدن سلول‌های جنینی از جفت و عدم ورود و آزاد شدن DNA آزاد جنینی به خون مادر به دلایل نامعلوم.

این پدیده اغلب در بارداری‌های مصنوعی IVF، Micro، (ART) مشاهده می‌شود که پدیده‌ای طبیعی است.

2- گاهی در بارداری‌های دوقلو (Twin) این پدیده مشاهده می‌شود که پدیده‌ای طبیعی است.

3- در برخی موارد نتایج I.R نشانه IUFD است.

4- دلایل تکنیکی در فرآیند جداسازی DNA جنین می‌تواند عامل نتایج I.R باشد.

5- آزمایش NIPT زودتر از هفته دهم انجام شده باشد.

                                                                                                                                    

مروری بر  تست Cell Free DNA

این تست برای اولین بار در سال 1997 توسط دکتر Dennis Lo با ردیابی قسمت هایی از کروموزوم Y جنین در خون مادر کشف شد.منشا این قطعات DNA از سلول های سیتوتروفوبلاست جفت می باشد.

در اولین تقسیم های سلولی بلاستومر حداقل سه رده سلولی وجود دارد:

 1.یکسری از سلول ها در انتها جنین را تشکیل می دهند.

2.یکسری تبدیل به سلول های سیتوتروفوبلاست  یا جفت می شوند.

3.یکسری از سلول های Syncytiotrophoblast که باعث اتصال جفت به جدار رحم می شوند.

 

3_13 درصد از کل DNA آزاد موجود در گردش خون مادر cfpDNA را تشکیل می دهد, نسبت بین cfPDNA به cfMDNA اصطلاحی را ایجاد می کند که به آن fetal fraction می گویند و نقش مهمی در صحت انجام تست بر عهده دارد. این نسبت باید حداقل 2_5 درصد باشد تا تست صحت پیدا کند.در سه ماهه سوم بارداری این نسبت به 10_20 درصد افزایش می یابد.cfpDNA از هفته 7 بارداری در خون مادر ظاهر و بلافاصله بعد از تولد نوزاد از گردش خون مادر پاک می شود به طوری که 2 ساعت پس از زایمان دیگر در خون مادر قابل تشخیص نیست.

از نظر اندازه این مولکول بسیار کوچکتر از cfmDNA بوده و ابعادی در حدود کمتر از 200bp دارد و این ویژگی اساس بسیاری از تکنیک های افتراق cfpDNA از cfmDNA  را تشکیل می دهد.

کاربرد cfDNA در زمینه های زیر می باشد:

* تعیین اختلالات آنوپلوئیدی شایع ( تریزومی 13،18 و 21)

*تشخیص فاکتورهای مربوط به ناسازگاری سیستم RhD

*تعیین جنسیت از نظر اختلالات ژنتیکی مرتبط با کروموزوم جنسی که سردسته این اختلالات عبارتند از: سندرم X  شکننده،دیستروفی عضلانی دوشن،هموفیلی،هیپرپلازی مادرزادی آدرنال(به دلیل مهار تولید کورتیکواستروئیدها هورمون های آندروژن افزایش یافته و اگر جنین دختر باشد باعث مردانه شدن اندام تناسلی خارجی وی می گردد و در این موارد باید از هفته 7 بارداری درمان با دگزامتازون را برای جنین های دختر شروع کرد و مانع از ترشح آندروژن ها شد)

*تست های اختلالات تک ژنی

*تعیین آنوپلوئیدی ها

طبق آخرین توصیه کمیته مشترک ACOG و SMFM (انجمن طب مادر و جنین) در سپتامبر ٢٠١٥:

١- باید pre-test and post-test consultation برای تست NIPT انجام شده و مزایا و محدودیت های تست به بیمار تفهیم شود.

٢- فقط برای بررسی تریزومی های شایع و در صورت درخواست بیمار جنسیت جنین استفاده شود.

٣- برای بررسی microdeletion استفاده نشود (بدلیل افزایش موارد مثبت کاذب تست و در نتیجه افزایش بی مورد تست های تشخیصی و مشکل بودن مشاوره به بیمار در موارد مثبت و عدم تعیین ادامه و یا ختم بارداری با توجه به وجود پلی مرفیسم های مختلف در جوامع مختلف)