مراحل تکنیک FISH
-
ابتدا پروبی (کاوشگر) که توالی آن مکمل توالی مورد نظر است ساخته می شود. پس از ساخت پروب، آن را توسط مواد فلورسنت نشاندار می کنند.
-
ثابت کردن نمونه ها (کروموزوم ها) بر روی اسلاید و دناتوره کردن و جدا سازی رشته های DNA از یکدیگر
-
دناتوره و جداسازی رشته های DNA پروب از همدیگر و قراردادن آن ها بر روی اسلاید. در این مرحله به پروب فرصت داده می شود تا به توالی مکمل خود متصل شود.
-
شستن پروب های اضافه و مشاهده کروموزوم ها توسط میکروسکوپ فلورسنت. پروب ها در زیر میکروسکوپ به صورت سیگنال های فلورسنت مشاهده می شوند. تعداد سیگنال ها بستگی به تعداد توالی مکمل دارد که پروب به آن ها متصل شده است.
به طور کلی سه نوع پروب در تکنیک FISH مورد استفاده قرارمی گیرند که هر کدام کاربرد متفاوتی دارند.
-
پروب های مخصوص جایگاه (locus specific probes): این پروب ها به جایگاه ویژه ای از کروموزوم متصل می شوند. کاربرد این پروب ها در مواردی است که بخواهیم جایگاه یک ژن را بر روی کروموزوم ها تعیین کنیم.
-
پروب های تکراری سانترومری یا آلفوئید (Alphoid or centromeric repeat probes): این پروب ها از توالی های تکراری که در محل سانترومر کروموزوم قرار گرفته اند ساخته می شوند. کاربرد این پروب ها زمانی است که بخواهیم ببینیم آیا در یک فرد چه تعداد کپی از کروموزوم ها وجود دارد.
-
پروب های کروموزومی (Whole chromosome probes): این پروب ها مجموعه ای از چند پروب کوچکتر هستند که هرکدام به توالی ویژه ای بر روی کروموزوم متصل می شوند. هریک از این پروب ها توسط رنگ فلورسانس متفاوتی نشان دار می شوند و در نتیجه هر کروموزوم با رنگ متفاوتی شناسایی می شوند. از این پروب ها در شناسایی ناهنجاری های کروموزومی (به طور مثال زمانی که یک قطعه از یک کروموزوم به انتهای کروموزوم دیگر متصل می شود) استفاده می شود.
مراحل انجام تکنیک FISH
کاربرد FISH
از جمله کاربردهای FISH می توان به موارد زیر اشاره کرد
-
تشخیص ناهنجاری های تعدادی و ساختاری (جابجایی ها، حذف و مضاعف شدگی ها) کروموزومی
-
شناسایی کروموزوم های مارکر
-
تعیین محل ژن های خاص بر روی کروموزوم
-
آنالیز ساختمانی ژنوم
-
تعیین سطح پلوئیدی
-
تشخیص نوع و مرحله انواع سرطان ها
-
تشخیص ژنتیکی پیش از لانه گزینی(PGD)
شکل بالا یک سلول موجود در مایع آمنیون را نشان می دهد که با استفاده از تکنیک FISH وجود سه کپی از کروموزوم 21 در آن تشخیص داده شده است. سینگال های قرمز مربوط به کروموزوم 21 می باشد. بنابراین جنین مبتلا به سندرم داون (تریزومی 21) می باشد.
References
Brandriff, B., Gordon, L. and Trask, B. (1991) 'DNA sequence mapping by fluorescence in situ hybridization', Environmental and molecular mutagenesis, 18(4), 259-262.
Fan, Y.-S., Davis, L. M. and Shows, T. B. (1990) 'Mapping small DNA sequences by fluorescence in situ hybridization directly on banded metaphase chromosomes', Proceedings of the National Academy of Sciences, 87(16), 6223-6227.
Henegariu, O., Artan, S., Greally, J. M., Chen, X.-N., Korenberg, J. R., Vance, G. H., Stubbs, L., Bray-Ward, P. and Ward, D. C. (2001) 'Cryptic translocation identification in human and mouse using several telomeric multiplex fish (TM-FISH) strategies', Laboratory investigation, 81(4), 483-491
Henegariu, O., Bray-Ward, P., Artan, S., Vance, G. H., Qumsyieh, M. and Ward, D. C. (2001) 'Small marker chromosome identification in metaphase and interphase using centromeric multiplex FISH (CM-FISH)', Laboratory investigation, 81(4), 475-481.
Henegariu, O., Dunai, J., Chen, X.-N., Korenberg, J. R., Ward, D. C. and Greally, J. M. (2001) 'A triple color FISH technique for mouse chromosome identification', Mammalian Genome, 12(6), 462-465.
Henegariu, O., Heerema, N. A., Bray-Ward, P. and Ward, D. C. (1999) 'Colour-changing karyotyping: an alternative to M-FISH/SKY', Nature genetics, 23(3), 263-264.
Henegariu, O., Heerema, N. A., Lowe Wright, L., Bray-Ward, P., Ward, D. C. and Vance, G. H. (2001) 'Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading, chemical aging and gradual denaturing', Cytometry, 43(2), 101-109.
Oliveira, A. M. and French, C. A. (2005) 'Applications of fluorescence in situ hybridization in cytopathology', Acta cytologica, 49(6), 587-594.
Tepperberg, J., Pettenati, M., Rao, P., Lese, C., Rita, D., Wyandt, H., Gersen, S., White, B. and Schoonmaker, M. (2001) 'Prenatal diagnosis using interphase fluorescence in situ hybridization (FISH): 2-year multi-center retrospective study and review of the literature', Prenatal diagnosis, 21(4), 293-301.
