راهنمای انجام آزمایش های ژنتیک

این راهنما و استانداردهای تکنیکی در ابتدا به عنوان منابع آموزشی برای متخصصین ژنتیک آزمایشگاه های بالینی توسعه یافتند تا به کیفیت خدمات ژنتیکی آزمایشگاه ها کمک شده باشد. علاوه بر این، استانداردها و راهنما ها به صورت اختیاری هستند و لزوما یک نتیجه پزشکی موفق را ارائه نمی دهند.  بنابراین، نباید این استانداردها و راهنما ها را به عنوان روشی شامل تمامی روش ها و تست های مناسب و مجموعه ای از آزمایش ها و فرایند هایی که به صورت معقول نتایج مشابهی را ارائه می دهند، در نظر گرفت. در تعیین مناسب بودن هر آزمایش یا روش خاص، ژنتیک شناس آزمایشگاه بالینی باید تصمیم تخصصی خود را در مورد شرایط خاص بیمار یا نمونه بیان کند. متخصص ژنتیک آزمایشگاه بالینی باید منطقی بودن کاربرد یک آزمایش یا رویه را در سوابق بیمار مستند کند چه مطابق استاندارد ها و راهنماها باشد چه نباشد. همچنین توصیه می شود که به تاریخ هر استاندارد و راهنمای تطبیق داده شده توجه گردد و دیگر اطلاعات علمی و پزشکی مربوط به بعد از آن تاریخ باید در نظر گرفته شود.

آنالیز پروفایل آسیل کارنیتین(ACP)، جهت غربالگری بیوشیمیایی اختلالات اکسیداسیون اسید های چرب (FAO)  ومتابولیسم اسیدهای آلی انجام می شود. در برخی موارد نتایج ACP برای یک اختلال خاص قابلیت تشخیصی دارند، در حالی که در دیگر موارد، جهت یک تشخیص دقیق تر، آزمایش های بیشتری مورد نیاز است. در آنالیز آسیل کارنیتین به طور معمول تجمع گونه های acyl- CoA c_{2 –} c₁₈  ارزیابی می شود که که به عنوان ماده اولیه برای یکی از چندین آنزیم  کارنیتین آسیل کوآ ترانسفراز بیان شده در قسمت های مختلف سلولی می باشند. گونه های آسیل کارنیتین به دست آمده در موقعیت های بالینی زیر اندازه گیری می شوند:

1. ارزیابی بیماران علامت دار

2. ارزیابی خواهر و برادر های بدون علامت )در معرض خطر( بیماران شناخته شده

3. غربالگری نوزادان و آزمایش های مربوط به پیگیری

4. تشخیص قبل از تولد

5. غربالگری پس از مرگ و کالبد شکافی

تقریباً تمام آزمایشگاه ها این آنالیز را با استفاده از اسپکترومتری جرمی متوالی (ms/ms)  انجام می دهند. روش های کمتر به کار گرفته شده شامل اسپکترومتری جرمی-گازکروماتوگرافی، کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا و الکتروفورز موئینگی می باشند. آنالیز صحیح آسیل کارنیتین نیازمند مهارت در عمل آنالیز و نیز تفسیر دقیق نتایج باه همراه گزارش نویسی مناسب است.

 

زمینه

توصیف بالینی بیماری:

اختلالات ارثی FAO ، شامل اختلالات مادرزادی متابولیسم (IEM) بوده که ممکن است در هر سنی از تولد تا بزرگسالی ظهور یابند و مکرراً با علائم تهدیدکننده حیات ناشی از ناکارآمدی متابولیسم به دنبال دوره ای از دریافت کالری ناکافی، همراه هستند. علائم عمومی شامل هیپوگلیسمی هیپوکتونیک، بیماری های کبد، اسکلتی، آسیب قلبی و در نهایت مرگ ناگهانی هستند.

اسیدمیای آلی یک گروه نا همگن تراز IEM  هستند. این بیماری ها به طور معمول با بیماری های حاد عود شونده، هیپو یا هیپرتونیا، نارسایی رشد و تأخیر رشد همراه هستند. علائمی که بطور معمول به شکل حاد ظهور میابند شامل استفراغ، بی حالی، کما و تشنج است.

 به جز در موارد استثنا، تشخیص این شرایط تقریبا نیازمند یک فرایند آزمایشگاهی است که در آن آنالیز آسیل کارنیتین یک جز کلیدی محسوب می شود. یک ارزیابی متابولیک جامع به طور معمول شامل آنالیز آمینواسیدهای پلاسما، اسیدهای آلی ادرار، و کارنیتین پلاسما ( آزاد و توتال) می باشد. بر اساس نتایج این مطالعات، ممکن است آزمایش های بیشتری نیز لازم باشد.

 

اختلالاتی که به طریق بیوشیمیایی توسط آنالیزآسیل کارنیتین قابل تشخیص هستند

آنالیزACP  امکان تشخیص اختلالاتFAO  و برخی اختلالات متابولیسم اسید های آلی را مشخص می کند. اختلالات تشخیص داده شده در آنالیز آسیل کارنیتین در جدول یک نشان داده شده است.

 

شیوع

میزان شیوع مجموعه این اختلالات بین 1:5000 تا 1:10000 در هر تولد زنده است.

 

نحوه توارث

 تمامی IEM قابل تشخیص با آنالیز آسیل کارنیتین، به عنوان صفات اتوزومال مغلوب به ارث می رسند به جز نقص 2- متیل 3- هیدروکسی بوریریل کوآ دهیدروژناز که وابسته به X  است.

 

ملزومات پیش از آنالیز

انواع نمونه

کارنیتین و استرهای آن تقریباً در تمام مایعات بیولوژیک  یافت می شوند. بهترین نمونه جهت آزمایش در بیماران دارای علائم و بیماران بدون علامت و در معرض خطر، استفاده از پلاسما یا سرم است. برخی آزمایشگاه ها نیز روش Dried blood spot را ترجیح می دهند که موجب سهولت حمل و نقل نمونه است و ممکن است سبب افزایش حساسیت در تشخیص اختلالات FAO با زنجیره طولانی گردد.آنالیزACP در ادرارکمتر انجام می شود، اگر چه این روش می تواند یک روش حساس برای تشخیص اسیدمی آلی مثل گلوتاریک اسیدمی نوع یک، نقص بیوتینیداز ، و نقص ایزوبوتیریل کوآ دهیدروژناز باشد. همچنین آنالیز ACP می تواند بر بافت های مختلف شامل فیبروبلاست ها، لنفوسیت ها و آمنیوسیت های کشت شده به خوبی ماهیچه و کبد هموژن انجام شود. غربالگری پس از مرگ می تواند روی dried blood spot یا مایع صفرا انجام گیرد و مایع آمنیوتیک برای تشخیص پیش از تولد IEMهای انتخابی به کار گرفته شود.

 

حجم نمونه

حجم جمع آوری نمونه و شرایط حمل و نقل و به کارگیری آنها باید توسط ازمایشگاه تعیین شود و برای پزشکان بر اساس درخواست باید در دسترس باشد. حجم نمونه های مورد استفاده رایج در جدول 1 ارائه شده اند.

شرایط  انتقال ، نگه داری و ذخیره

نمونه های روی کاغذ فیلتر خشک شده می توانند در دمای اتاق حمل شوند. دیگر انواع نمونه ها باید به سرعت فریز و بر روی یخ خشک به آزمایشگاه منتقل شوند. ذخیره طولانی مدت در دمای اتاق می تواند منجر به کاهش آسیل کارنیتین شود که در طی آن تخریب نمونه های با زنجیره کوتاه سریعتر از تخریب نمونه های با زنجیره بلند  اتفاق می افتد. ترکیبات زمانی که در ̊ c80- نگهداری می شوند پایدار هستند. معیار های رد نمونه باید توسط آزمایشگاه تعیین و مستند سازی شوند.

 

اعتباربخشی 

کالیبراسیون و کمی سازی

استاندارد های داخلی، ایزوتوپ های پایدارهستند که از طریق منابع تجاری مختلف در دسترس هستند. تایید این استانداردها باید از طریق تعیین بازیابی استانداردهای آسیل کارنیتین متناظر غیر ایزوتوپ تعیین شود. استاندارد های داخلی باید به صورت دوره ای و متناوب توسط آزمایشگاه تایید شوند.

 استانداردهای مرجع برای تمامی گونه های آسیل کارنیتین به ویژه برای گونه های هیدروکسی در دسترس نیست،. کمی سازی این ترکیبات باید با بکار گیری کالیبراسیون برای گونه های نزدیک به نمونه مورد نظر از نظر ساختاری، انجام گردد.

آزمایشگاه موظف به تعیین بازه خطی، بازه ی اندازه گیری آنالیتیک و محدوده پایین تشخیص برای تمام آسیل کارنیتین های مفید بالینی در صورت امکان، می باشد. این ویژگی های عملکردی باید به صورت منظم توسط CLIA  تایید شود.

 

محدوده مرجع

برای تمامی آسیل کارنیتین های گزارش شده باید محدوده مرجع تعیین و به صورت دوره ای تایید شود. زمانی که محدوده مرجع بر پایه مطالعات قبلی مورد استفاده قرار گیرد، این محدوده باید قبل از استفاده توسط آزمایشگاه تایید شود. برای تمامی کاربری ها به جز غربالگری پس از مرگ و آنالیز بافت، محدوده ی مرجع باید متناسب با سن باشد. به طور خاص، مقایسه نتایج مربوط به امراض کودکان در نقطه ی خون خشک شده، پلاسما و بازه های اصلی سرم با محدوده مرجع به دست آمده از یک جمعیت بزرگسال ، مناسب نیست.

 

ارزیابی پرسنل

آموزش مناسب و صلاحیت مداوم کارکنان آزمایشگاه برای اجرای آنالیز ACP باید تعیین و مستندسازی شود. به ویژه  برای ارزیابی به روش MS/MS ، بهینه سازی ابزار سنجش، تایید روش ها و روند آزمایش باید توسط پرسنل آموزش دیده در اجرای MS/MS انجام شود.

 

آنالیز آسیل کارنیتین ها

آماده سازی نمونه

آسیل کارنیتین ها اغلب با بوتیل استرهاشان آنالیز می شوند، اگر چه آنالیز نمونه های مشتق نشده نیز ممکن است و همچنین روش های جایگزین مشتق سازی (شامل میتلاسیون) گه گاه به کار می رود. یک روش رایج آماده سازی نمونه پلاسما در آنالیز آسیل کارنیتین در زیر خلاصه شده است. ( روش های خاص باید تعیین و توسط هر آزمایشگاهی تأیید شود) :

نمونه ها با مخلوطی از استانداردهای داخلی نشان دارشده با دوتریوم حل شده در استونیتریل اسیدی شده با فرمیک اسید یا متانول 0.3% رقیق می شوند. استانداردهای داخلی عموماً شامل d₃-C2، d₃-C3 ، d₃-C4 ، d₉-C5 ، d₃-C8 ، d₉-C14 و d₃-C16 می باشند. دیگر استاندارد های داخلی نیز می توانند مورد استفاده قرار گیرند، اما در این شرایط باید مراقب تداخل سیگنال گونه های مرتبط بالینی بود. نمونه ها سانتریفیوژ شده و  محلول رویی شامل آسیل کارنیتین های استخراج شده به یک لوله دیگر انتقال یافته و تبخیر شده تا  تحت نیتروژن خشک شوند. آسیل کارنیتین ها با اضافه کردن HCL سه نرمال در –n بوتانول به بوتیل استرهایشان مشتق می شوند و به مدت 15 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد حرارت داده می شوند. نمونه ها مجدداً تبخیر گشته و تحت نیتروژن خشک می شوند و نهایتاً در فاز متحرک دوباره تشکیل می گردند.

 

روش های آنالیز

برای آزمایش با روش MS/MS ، آسیل کارنیتین ها بدون جداسازی کروماتوگرافیک در حالت یون مثبت، با استفاده  از اسکن یون پیش ساز ( همچنین یون والد نامیده می شود) و یا کنترل واکنش چندگانه (MRM)  آنالیز می شوند. اسکن یون پیش ساز ارجحیت دارد چرا که امکان ارزیابی کل پروفایل و جستجوی مصنوعات دارویی رایج، حضور ترکیبات مداخله کننده و ظهور مشتقات اندک را فراهم می کند. جدا سازی کروماتوگرافیک زمانی مورد استفاده قرار می گیرد که جداسازی ایزومر ها مد نظر بوده و از نظر بالینی مناسب باشد. اگر چه این نتایج به صورت ساده تر از طریق سایر آزمایش ها مانند اسید های آلی ادرار یا آنالیز آسیل گلیسین قابل دسترس می باشد.

نمونه مایع از طریق یک لوله موئینه به منبع یونی وارد می شود و در معرض یک زمینه قوی الکتریکی و یک جریان نا همسو از گاز نیتروژن قرار می گیرد(یونیزاسیون الکترواسپری یا ESI ). این کار موجب تبخیر حلال و دفع یونهای باردار به سمت آنالیزور جرمی می گردد. ESI   تحت فشار اتمسفری رخ می دهد و امکان یونیزاسیون بهینه را فراهم می کند در حالیکه آنالیزور جرمی در فشار بسیار پایین عمل می کند. ترکیب این دو روش با ورود یونها به داخل آنالیزور از طریق یک سوراخ بسیارکوچک (کمتراز یک میلی متر) و استفاده از پمپ های خلاء قوی امکان پذیر می باشد.

 در یک سیستم چهارقطبی استاندارد سه تایی، اولین و سومین چهار قطبی را می توان جهت اسکن یک محدوده جرمی و یا  انتخاب یک یا تعداد بیشتری از یون ها تنظیم کرد. کوادراپل دوم به عنوان یک سلول برخورد، در جایی که جداسازی یونها در مسیر عبور افزایش یافته است، به کار گرفته می شود. در روش پیش ساز یون جهت آنالیز مشتقات بوتیله شده، تمامی پیش ساز های محصولات 85 m/z داخل یک محدوده جرمی بین 200 تا 500 m/z  ثبت شده اند. در آنالیز MRM، جفت یون های والد مناسب باید برای تشخیص واضح هرگونه ای از آسیل کارنیتین تعیین گردد. اگر چه، این موضوع همیشه ممکن نیست. به طور مثال ، جفت یون پیش محصول آسیل کارنیتینC₄- (288/85) می تواند به صورت بوتیریل کارنیتین، ایزوبوتیریل کارنیتین و فورمیمینوگلوتامات نمایش داده شود. گونه های آسیل کارنیتین با توجه به وزن ملکولی یون های⁺ [M+H] متعلق به مشتقات بوتیل استریشان در جدول 2  لیست شده اند.

 

کنترل کیفیت

نمونه کنترل منفی و مثبت باید با هر سری مریض، آماده و آنالیز گردد. همچنین مخلوط استاندارد داخلی نیز باید به طور جداگانه و همراه با هر سری آنالیز گردد.

 یک برنامه کنترل کیفیت (QC) براساس آنالیز کمی نمونه های کنترل طبیعی و غیر طبیعی باید در یک روند منظم مورد استفاده قرار گیرد. محدوده های هدف باید برای هر متابولیت تعیین و جهت پذیرش یا رد هر سری  از  QCانجام شده، مورد استفاده قرار گیرد. استاندارد های داخلی در هرنمونه به عنوان کنترل کیفی برای هر نمونه به کار می رود. استفاده از قوانین وستگارد برای آنالیزنمونه های بالینی، کیفیت پارامترهای تشخیصی و گزارش برای بیمار را کنترل می کند. یک طرح QC  باید مقادیر کنترل را به صورت ماهانه جمع آوری، مرور و تأیید کند.

 

تست مهارت

برای آنالیز آسیل کارنیتین باید یک برنامه تست مهارت مداوم (PT) اجرا و مستندسازی شود. یک برنامه دوسالانه PT  برای ACP توسط کالج آسیب شناسان آمریکا (CAP) پیشنهاد شده و توسط CAP و کالج آمریکایی متخصصین ژنتیک پزشکی و کمیته مرجع ژنتیک مولکولی تحت نظارت قرار گرفته است. همچنین یک برنامه اطمینان کیفیت روش blood spot آسیل کارنیتین توسط شبکه تحقیق اروپایی برای ارزیابی و بهبود غربالگری، تشخیص و درمان اختلالات ارثی متابولیسم پیشنهاد شده است.

 

گزارش و تفسیر آزمایش

تفسیر

نتایج باید توسط یک متخصص ژنتیک بیوشیمی (ABMG) تائید شده، مرور و تفسیر شوند. نتایج مفید معمولاً توسط یک الگو از یک یا تعداد بیشتری از گونه های آسیل کارنیتین افزایش یافته در مقایسه با محدوده های مرجع متناسب سن مشخص می شوند. تفسیر نتایج براساس تشخیص الگوها و ارتباط یافته های مثبت و منفی به جای استفاده از مقادیر غیر طبیعی هر فرد انجام می گیرد. تشخیص افتراقی نتایج غیر طبیعی گونه های متفاوت که نشان دهنده ایزومرهای چند گانه هستند (C₅-DC ، C₅ – OH ، C₅ وC₄ ) بحرانی است. الگوهای آسیل کارنیتین پایه مرتبط با حالت های مختلف بیماری در جدول 4 لیست شده اند.

 

علاوه بر نشانگر های اولیه لیست شده در جدول 4، محاسبه ی نسبت ها( به طور مثال نسبت C8/C10 در نقص MCAD) در تفسیر نتایج غیر طبیعی مفید است. پروفایل های آگاهی دهنده ممکن است همیشه در اختلالاتی که تجمع گونه های تشخیصی انعکاسی از فعالیت آنزیم معیوب یا رژیم غذایی غنی از کارنیتین یا پیش ساز ها و وضعیت متابولیک بیمار است، قابل تشخیص نباشد. ناهنجاری های جزئی باید به سطوح کارنیتین بیمار به عنوان یک وضعیت از کمبود کارنیتین مرتبط باشد که می تواند نتیجه  آنالیز را تحت تأثیر قرار دهد.

چندین دارو (به طور مثال اسید والپوریک، اسید پیوالیک و سفوتاکسیم) ممکن است سطوح غیر طبیعی از یک یا تعداد بیشتری از گونه های آسیل کارنیتین شناخته شده را ایجاد کنند. دیگر ترکیبات اگزوژن ( متابولیت های دارویی، افزودنی های غذایی، دکستروز داخل وریدی) نیز می توانند منجر به ظهورگونه های غیر معمول اسیل کارنیتین شوند که برخی از آنها در مقادیرm/z  نزدیک و یا حتی در حالت هم پوشانی  با گونه های تشخیصی آسیل کارنیتین هستند. رژیم مواد غذایی نیز ممکن است ایجاد تداخل کنند که معمولاً مربوط به دریافت غذاهایی غنی شده با اسید های چرب مربوط می شود.

 

گزارش

گزارش های بیمار باید شامل اطلاعات مناسبی از بیمار و نمونه باشند. در صورت بروز نتایج غیر طبیعی، تفسیر باید شامل مروری از نتایج و اهمیت آنها، نتایج کمی با محدوده های مرجع متناسب با سن، ارتباط بین اطلاعات بالینی در دسترس و تفسیر تست، عناصر تشخیص افتراقی، توصیه برای آزمایش های بیوشیمیایی بیشتر و مطالعات in vitr تأییدی( به طور مثال اندازه گیری آنزیم، آنالیز مولکولی) و یک شماره تلفن برای دسترسی به آزمایشگاه گزارش دهنده برای سؤالات اضافی باشد. مقادیر مرجع آسیل کارنیتین وابسته به سن نیازمند این هستند که نتایج کمی در برابر یک گروه سنی تعریف شده تطابق داده شوند.