تشخیص آمینواسیدوپاتی ها

آنالیز 1) آمینواسیدهای پلاسما  2) اسیدهای آلی ادرار و 3) آسیل کارنیتین های پلاسما ، تکیه گاه اصلی برای تشخیص اغلب آمینواسیدوپاتی ها ، افزایش اسیدهای آلی و اختلالات اکسیداسیون اسیدهای چرب است. به دلیل عملکرد این تست ها در تشخیص زودهنگام افراد بدون علامت طی غربالگری نوزادان، حساسیت و ویژگی این روشها باید بسیار زیاد باشد تا قادر به شناسایی متابولیت های تشخیصی درغلظتهای کم  نیز باشد. به علاوه محدوده ی نرمال متناسب با هر سن باید در دسترس باشد، زیرا سطح بعضی متابولیت ها نظیر آسیل کارنیتین با افزایش سن مرتبا تغییر می کند.

 

آنالیز آمینواسید با کروماتوگرافی تعویض یون

روشهای مختلفی برای آنالیز آمینواسیدهای موجود در مایعات بیولوژیکی مثل پلاسما ، ادرار و مایع مغزی نخاعی وجود دارد که شامل جداسازی کروماتوگرافیک آمینواسیدها با یپش ستون (کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) و روشهای کروماتوگرافی گازی یا GC) یا با پس ستون مشتق ساز (کروماتوگرافی تعویض یون)  است که با طیف سنج ماوراءبنفش (UV)، فلورسانس یا طیف سنج جرمی آشکارسازی می شود. با وجود این که مطالعات اخیر با استفاده از دو طیف سنج جرمی پشت سرهم نتایج ایده آلی نشان می دهد، اما روش کروماتوگرافی تعویض یون همچنان به عنوان روش استاندارد طلایی برای آنالیز آمینواسیدها باقی مانده است.  پارامترهای مهم در آنالیز آمینواسیدها  1) داشتن محدوده ی وسیع  2) داشتن حد تشخیص بسیار پایین  3) داشتن حد خطی بالا، به علاوه، لازم است ایزومرها جداسازی و اندازه گیری شوند. با کروماتوگرافی تعویض یون، نمونه (پلاسما، ادرار، مایع مغزی نخاعی) پروتئین زدایی شده و به یک ستون تعویض یون (عموما یک ستون تعویض یون کاتیونی لیتیومی) تزریق می شود. آمینواسیدها براساس تغییر PK_a، با تغییر PH و قدرت یونی بافرهای شستشو دهنده و دمای ستون جداسازی می شوند. ابتدا آمینواسیدهای اسیدی ، سپس آمینواسیدهای خنثی و سرانجام آمینواسیدهای بازی شسته می شوند. پس از شستشوی آمینواسیدها از ستون، آمینواسیدها با  ninhydrinدردمای    135 درجه سانتی گراد مخلوط شده تا یک ترکیب رنگی ایجاد شود. شدت جذب آنها متناسب با غلظت آمینواسیدهاست. جذب در دو طول موج متفاوت خوانده می شود: 570 نانومتر(ماکسیمم جذب برای آمینواسیدها) و440 نانومتر(ماکسیمم جذب برای ایمینواسیدها، مثل پرولین و هیدروکسی پرولین). غلظت آمینواسیدها با استفاده از یک استاندارد داخلی و کالیبراسیون خارجی محاسبه می شود.تشخیص جداگانه ی هرآمینواسیدبرمبنای زمان نگه داری (retention time) ، نسبت جذب در دو طول موج (570/ 440) و در مواقعی که کماکان تردید وجود دارد، استاندارد به نمونه افزود میشود. نمونه ی پلاسما درشرایط ناشتا نمونه مناسب جهت آنالیز آمینو اسیدها محسوب می شود. در نوزادان و کودکان، نمونه باید حداقل با دوساعت فاصله با آخرین وعده ی غذا، گرفته شود.به دلیل اشتقاق محصولات مصنوعی از روند لخته شدن، باید از جمع آوری سرم به عنوان نمونه پرهیز کرد.نمونه ی خون باید با ترکیبات ضدانعقاد (لیتیم- سدیم هپارین) جمع آوری شده و بلافاصله جدا شده و تا زمان آنالیز فریز شود. نگهداری نمونه در دمای نامناسب، در دمای اتاق یا یخچال، منجر به دآمیناسیون گلوتامین و اتصال اسیدهای آمینه سولفوره به پروتئین میشود. غلظت اکثر آمینواسیدها در سلولهای قرمز خیلی مشابه غلظت آنها در پلاسما است، هرچند بعضی آمینواسیدها (مثل آسپارتیک اسید، taurine، گلوتامیک اسید) در سلولهای خونی قرمز در غلظت های بالاتر وجود دارند بنابراین همولیز منجر به افزایش غیرواقعی غلظت آن دسته آمینواسیدها خواهد شد. به علاوه سلولهای خونی قرمز دارای آنزیم آرژیناز هستند که آرژنین را به اورنیتین و اوره تبدیل میکند. همولیز ممکن است منجر به رهاسازی این آنزیم و در نهایت کاهش غلظت آرژنین و افزایش غلظت اورنیتین گردد. نتایج آنالیز میزان آمینواسید پلاسما معمولا با واحد میکرومول بر لیتر گزارش می شود.

ارزیابی آمینواسیدهای ادرار معمولا فقط برای تحقیق در مورد اختلالات انتقال آمینواسیدها ( مثل cystinuria، عدم تحمل پروتئین Lysinuric، اختلال Hartnup) یا نقص پرولیداز استفاده می شوند. یک نمونه ی ادرار تصادفی بدون نگهدارنده،معمولا برای ارزیابی آمینو اسید ها مناسب است هرچند در بررسی بازجذب آمینو اسید ها نمونه مناسب معمولا ادرار 24 ساعته است. نمونه باید بدون نگهدارنده جمع آوری شده و تا پایان جمع آوری 24 ساعته در یخچال نگه داری شود. نمونه های ادرار ،همانند نمونه های پلاسما، باید هر چه سریع تر فریز شده و تا زمان آنالیز  به همین صورت  نگه داری شوند. نتایج معمولا با غلظت کراتینین موجود در نمونه باید نرمال شود.

آنالیز آمینواسیدهای موجود درمایع مغزی نخاعی برای موردهای بسیار خاص، مثل تشخیص آنسفالوپاتی گلایسین(هایپرگلایسمی غیر کتونی) و در اختلالات مرتبط با سوخت و ساز سرین انجام میشود. مایع مغزی نخاعی باید بدون آلوده شدن به خون جمع آوری شده،  بلافاصله فریز شود و تا زمان آنالیز،  به همین صورت باقی بماند. میزان آمینواسیدهای موجود در مایع مغزی نخاعی با واحد میکرومول برلیتر بیان میشود. نتایج آمینواسیدها بی توجه به نوع نمونه، باید با وضعیت بالینی، رژیم و داروهای مصرفی مطابقت داشته باشد.

 

آنالیز اسیدهای آلی ادرار با کروماتوگرافی گازی- طیف سنج جرمی (GC-MS)

اصطلاح اسیدهای آلی شامل متابولیت های ناشی از اکثرمسیرهای متابولیک واسط و ترکیبات خارجی است.اسیدهای آلی آنالیز شده با کروماتوگرافی گازی-طیف سنج جرمی برمبنای میزان تبخیر و حل شوندگی در فاز ساکن و مایع غیرقطبی ستون کپیلاری کروماتوگرافی گازی جداسازی می شوند.

قبل از اینکه جداسازی با GC-MS انجام شود، اسیدهای آلی باید 1) معمولا با یک حلال آلی استخراج شوند     2) به یکی از مشتقات تری متیل سیلیل(TMS) تبدیل شوند   3) در حلالهای آلی حل شوند. با این تکنیک، از طیف سنج جرمی به عنوان یک آشکارساز استفاده می شود، بنابراین اسیدهای آلی هم براساس زمان نگه داری (retention time) و هم با استفاده از مشخصات طیف پراکنش ( fragmentation spectrum) می توانند شناسایی شوند. معمولا برای این آنالیزها یک نمونه ی ادرار تصادفی استفاده می شود، هرچند نمونه هایی با بیشترین اطلاعات برای تشخیص نقایص مادرزادی متابولیک، در هنگام حملات متابولیکی حاد (acute metabolic decompensation) جمع آوری می شود. آنالیز اسیدهای آلی موجود در خون یا مایع مغزی نخاعی معمولا برای شروع یک تشخیص اطلاعات زیادی به دست نمی دهد. تفسیر این نمونه ها ممکن است چالش برانگیز باشد، زیرا ممکن است صدها نوع ترکیب متفاوت در نمونه وجود داشته باشد. فاکتورهای کلیدی برای تفسیر درست نتایج شامل: 1) شناسایی الگوهای غیرعادی و تداخل های احتمالی به دلیل رژیم غذایی یا مصرف دارو  2) آگاهی راجع به اختلالات متابولیکی و تظاهرات این بیماری ها و   3) اطلاعات در مورد حالات بالینی بیمار می باشد.

 

پروفایل اسیل کارنیتین پلاسما

آسیل کارنیتین از ترکیب کارنیتین با acyl-CoA مشتق می شود. کارنیتین (3-هیدروکسی -4-(تری متیل آزانیومیل)بوتانوآت) یک ملکول قابل حل در آب است که برای انتقال اسیدهای چرب با زنجیره بلند  موجود در میتوکندری برای بتا اکسیداسیون  ضروری است. به علاوه، کارنیتین در چندین اسیدمی آلی و در اختلالات اکسیداسیون اسیدهای چرب جهت دفع راحت تربه بخش آزاد آسیل متصل شده  که در نهایت موجب انباشتگی می شود. در حضور یک سد متابولیک  (اسیدمی آلی یا اختلالات اکسیداسیون اسیدهای چرب)، اسیل کارنیتین های خاص ، مشتق از ترکیب کارنیتین با acyl-CoA بعد از سد متابولیک، روی هم انباشته شده که یک الگوی خاص برای هر بیماری ایجاد می کند. بنابراین آنالیز آسیل کارنیتین نقش حیاتی در تشخیص اختلالات متابولیکی ایفا می کند. انجام این قبیل آنالیزها معمولا به وسیله ی دو طیف سنجی جرمی پشت سرهم(MS/MS) با یا بدون جداسازی با کروماتوگرافی مایع پیش از آشکارساز MS/MS ، انجام می شود. نمونه ی سرم/پلاسما مایعات بیولوژیک مناسب جهت انجام تست هستند و برای غربالگری نوزادان، از لکه خون روی فیلترکاغذی استفاده می شود.

غلظت آسیل کارنیتین -مخصوصا برای آسیل کارنیتین با زنجیره بلند - در پلاسما و خون کامل متفاوت است. دلیل این امر شاید اتصال آسیل کارنیتینهای بلند زنجیره به غشاء سلولهای خونی باشد که منجر به کاهش میزان گونه های با زنجیره بلند در پلاسما می شود. پلاسما برای آنالیز آسیل کارنیتین ها باید بلافاصله بعد از نمونه گیری جمع آوری و تا زمان آنالیز، فریز شود.  ثابت شده که همولیز منجر به افزایش میزان آسیل کارنیتین های با  زنجیره بلند شد و در نهایت سبب اشتباه در تشخیص می گردد. جمع آوری نمونه در دمای اتاق یا حتی دمای یخچال ممکن است باعث هیدرولیز و در نتیجه کاهش غلظت آسیل کارنیتین ها شود. آنالیز آسیل کارنیتین های موجود در نمونه ی ادرار فقط برای تشخیص و بررسی پزشکی اختلالات ویژه ،مثل گلوتاریک اسیدمی نوع I، و فقط در صورت همسانی نتایج با بقیه تستها انجام می شود. برای اندازه گیری کمی آسیل کارنیتین ها معمولا از رقیق سازی ایزوتوپ های پایدار استفاده می شود، هرچند برخی از استانداردهای داخلی دوتریم دار شده برای همه ی انواع آسیل کارنیتینهای شناخته شده در دسترس نیست. وقتی نتایج آسیل کارنیتین از آزمایشگاه های مختلف با هم مقایسه می شوند، باید مراقب بود،زیرا نتایج بسته به استاندارد داخلی  مورد استفاده، می تواند متفاوت باشد.

 

محدوده  مرجع (reference intervals)

برای تفسیر تستهای ژنتیکی بیوشیمیایی باید از محدوده مرجع متناسب با سن استفاده کرد. محدوده  مجاز برای اسیدهای آلی ادرار، آسیل گلایسین های ادرار، پلاسما و آسیل کارنیتین های ادرار در جداول 1 و 2 لیست شده اند.

سنجش آنزیم و آزمون DNA

برخی اختلالات موروثی متابولیسم یک الگوی مشخصاتی از متابولیتها ایجاد می کند که در شرایط دیگر مشاهده نمیشود. اما در اکثر موارد تشخیص باید با یک روش منحصربه فرد دیگر شامل اندازه گیری فعالیت آنزیم یا انتقال دهنده ی ناقص و/ یا آزمون DNA تطبیق داده شود. این تایید بسیار حیاتی است، زیرا در بسیاری موارد، درمانهای ویژه، اگر در دسترس باشند، برای تمام زندگی ادامه یافته یا شامل شرایط بسیار بحرانی(پیوند اعضا یا مغز استخوان) می شوند. به علاوه، در بعضی اختلالات متابولیک، ارتباط ژنوتیپ- فنوتبپ با جهش های خاص بر تشخیص بیماری تاثیر میگذارد. برای برخی بیماریها، مثل فنیل کتونوریا، آنزیم جهش یافته  فقط در ریه بیان می شود، پرکابرد نبوده و تایید تشخیص با سنجش آنزیم، بسیار تهاجمی است. آزمایش DNA (با توالی یابی کل ژنوم) در این مورد بسیار مفید است. در شرایط دیگر، آنزیم مفقود شده  در سلولهای خونی یا در فیبروبلاست بیان می شود که از طریق بیوپسی پوست به دست می آید. باید این نکته را مورد توجه قرار داد که با کاهش هزینه ی آزمایش DNA، این تکنولوژی به صورت گسترده ای جهت تایید تشخیص نهایی استفاده می شود. محدودیت اصلی توالی یابی DNA این است که در شرایط خاص، ناهنجاری های بیوشیمیایی یکسان می تواند در اثر نقص در هریک از چندین ژن مشخص رخ دهد (مثلا دراسیدمی متیل مالونیک)، یا حضورچندین  ژن جهت کد کردن تمام زیرواحدهای یک آنزیم ضروری است (ازجمله بیماری ادراری شیره ی افرا). به علاوه توالی یابی DNA 1) ممکن است نتواند همه جهش های عامل بیماری را تشخیص دهد  2) ممکن است یک حذف/ تکثیر منفرد را از دست بدهد   3) می تواند تغییرات توالی جدید با اهمیت بالینی ناشناخته را تشخیص دهد. به همین دلیل، مطالعات مولکولی و بیوشیمیایی باید در یک راستا انجام شوند تا تشخیص یک اختلال متابولیکی را تایید یا تکذیب کنند.