تشخیص آزمایشگاهی بیماریهای باکتریایی:
ردیابی و شناسایی باکتریها توسط پنج روش رایج در نمونه های بالینی صورت می گیرد:
1 -1 میکروسکوپی
2 -2 ردیابی آنتی ژن باکتریایی
3 -3 ردیابی اسید نوکلئیک اختصاصی باکتری
4 -4 کشت
5 -5 ردیابی آنتی بادی اختصاصی باکتری (سرولوژی)
هرچند بیشتر ارگانیسم ها را می توان با تکنیک های متنوع به صورت اختصاصی شناسایی نمود، اما رایج ترین روش مورد استفاده در آزمایشگاه تشخیص طبی برای شناسایی و تعیین هویت یک ایزوله (متعاقب کشت) توسط تست های بیوشیمیایی صورت می گیرد؛ بنابراین با شناخت روشها و تست های بیوشیمیایی و با کمک از مورفولوژی میکروسکوپی و ماکروسکوپی می توان به وجود عامل بیماری پی برد و آن را شناسایی کرد. در این مقاله سعی بر آن شده است که  تست های متنوع و پرکاربرد (بیشترباکتریهای گرم مثبت) در آزمایشگاه میکرو بشناسی مورد بررسی قرار گیرد.

مروری بر چند تست رایج:
تست کوآگولاز:
در میکروبشناسی ازاین تست برای جداسازی استافیلوکوک اورئوس ازبقیه استافیلوکوکها استفاده می شود . در این تست از پلاسمای خرگوش یا انسان همراه با 1% EDTA یا سدیم سیترات 3- 2% استفاده می شود. در 5. 0سی سی پلاسمایی که به نسبت 1 به 5 با سرم فیزیولوژی رقیق شده است، چند کلنی را حل کرده و در 37 درجه سانتیگراد انکوبه می شود. بعد از 1 تا 4 ساعت از نظر ایجاد لخته بررسی نموده و در صورت منفی بودن 24 ساعت بعد نیز بررسی می شود.

تست کوآگولاز اسلایدی:
روی یک لام یک یا دو کلونی در سرم فیزیولوژی حل می کنیم تا سوسپانسیون یکنواختی حاصل شود. یک قطره پلاسما به سوسپانسیون افزوده و با کمک لوپ، سوسپانسیون یکنواختی ایجاد می کنیم. ایجاد توده لخته مانند در مدت 5 تا 10 ثانیه بیانگر مثبت بودن تست است و در صورتی که تست کوآگولاز اسلایدی منفی شود باید روش لوله ای را انجام داد.

تست کاتالاز:
یکی از موارد استفاده از این تست برای جداسازی استافیلوکوک ها از استرپتوکوک ها می باشد.استافیلوکوکها کاتالاز مثبت، ولی استرپتوکوک ها کاتالاز منفی هستند.آب اکسیژنه یکی از محصولات نهایی متابولیسم اکسیداتیو باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری است که تجمع آن برای باکتری خطرناک است. آنزیم کاتالاز موجود در باکتری، این ماده خطرناک را به H2O و O2 تجزیه می کند.
یک یا دو قطره آب اکسیژنه 3% روی لام ریخته و چند کلونی داخل آن حل می کنیم. در صورتی که باکتری کاتالاز مثبت باشد به سرعت شروع به تولید O2 می کند که به صورت حباب هایی روی سطح لام مشاهده می شود. باید توجه داشت که استفاده از لوپ فلزی ممکن است مثبت کاذب دهد.
چنانچه از محیط بلادآگار استفاده شود، از ریختن آب اکسیژنه به طور مستقیم بر روی آن خودداری نموده و حتماً تست را روی لام انجام دهید زیرا گلبول های قرمز خود آنزیم کاتالاز دارند و تست به صورت مثبت کاذب، خوانده می شود. آب اکسیژنه موجود در بازار به صورت 30 % می باشد، بنابراین آب اکسیژنه 3% از فرمول C1V1=C2V2 بدست می آید.

تست :DNase
اغلب سویه های استافیلوکوک اورئوس توسط تست کوآگولاز مشخص می شوند، ولی برخی از آنها واکنش کوآگولاز ضعیف دارند که می توان از تست DNase برای تشخیص آ نها استفاده کرد. تقریباً تمامی استافیلوکوک اورئوس ها DNase مثبت هستند.
روش انجام تست:
باکتر یها را روی محیط DNase کشت داده و به مدت 24 - 18 ساعت در 37 درجه سانتی گراد انکوبه کرده و پس از آن چند قطره HCL یک نرمال روی کلونی ها می ریزیم. اگر در اطراف کلونی ها ناحیه شفاف ظاهر شد دلیل بر مثبت بودن تست و اگر ناحیه تیره و مات ایجاد شود دلیل بر منفی بودن آن است.

تست هیدرولیز L) PYR پیروگلوتامیک اسید بتانفتیل آمید):
هدف انجام این تست تشخیص احتمالی استرپتوکوک گروه A و انتروکوک از سایر استرپتوکوک هاست.استرپتوکوک پیوژنز و گونه های جنس انتروکوک قادر به هیدرولیز PYR هستند این تست برای تشخیص استرپتوکوک پیوژنز اختصاصی تر از تست حساسیت به باسیتراسین بوده و برای انتروکوک به اندازه تست بای لاسکولین و کلریدسدیم اختصاصی می باشد. باکتری توسط پپتیدازهای خود PYR را هیدرولیز می کند و بتانفتیل آمید تولید می شود که با اضافه کردن معرف سیانامید رنگ قرمز تولید می گردد.
روش انجام تست:
به دیسک کاغذی آغشته به PYR که قبلاً مرطوب شده مقداری از باکتری را تلقیح می کنیم و بعد از گذشت دو تا سه دقیقه مقداری از معرف سیانامید به آن اضافه می کنیم. تولید رنگ قرمز نشا ندهنده مثبت بودن تست است.

تست حلالیت در صفرا:
حلالیت در صفرا یکی از خصوصیات باکتری پنوموکوک است که به موازات تست حساسیت به اپتوچین برای تشخیص این باکتری بکار می رود. این باکتری بعد از اینکه با صفرا مواجه می شود، اتولیزین های موجود در باکتری فعال شده و استرپتوکو کها را لیز می کنند.
از صفرای 10 % گاوی یا خرگوش که استریل شده است، استفاده می شود. سوسپانسیون غلیظی از باکتری موردنظر را به دزوکسیکولات سدیم اضافه کرده و پس از 3 ساعت انکوبه در 35 درجه سانتی گراد کدورت مایع موردنظر بررسی می شود.
 

تست اپتوچین:
این تست در تشخیص استرپتوکوک پنومونیه استفاده می شود.محیط بلادآگار با کلونی موردنظر کشت داده می شود. یک دیسک اپتوچین (اتیل هیدروکوپروئین هیدروکلراید) در وسط پلیت قرار داده و پلیت را در جار شمع در دمای 35 الی 37 درجه به مدت 24 ساعت انکوبه می کنیم. اگر رشد باکتری در اطراف دیسک مهار شود باکتری به اپتوچین حساس بوده و احتمالاً پنومونیه است.

کشت ادرار:
یکی از تست های روتین در آزمایشگاه تشخیص طبی، تست آنالیز و کشت ادرار می باشد که یک روش غیرتهاجمی برای بررسی وضعیت بدن است. برای تشخیص آزمایشگاهی عامل باکتریایی، جمع آوری و انتقال مناسب نمونه به آزمایشگاه، اهمیت دارد و همچنین نمونه به جهت افزایش امکان ردیابی پاتوژن های اختصاصی، باید مورد بررسی قرار گیرد. به دلیل اینکه اکثر ارگانیسم های بالقوه بیماری زا، در مجاری ادراری کلونیزه می شوند، بهتر است نمونه، ادرار صبحگاهی باشد. همچنین قسمت اولیه ادرار نباید مورد آزمایش قرار گیرد.
پاتوژن های مجاری ادراری می توانند در ادرار رشد کنند، بنابراین نباید در انتقال نمونه ها به آزمایشگاه تأخیری ب هوجود آید و اگر امکان کشت سریع نمونه وجود ندارد باید نمونه را در یخچال یا در محلول نگهدارنده ادرار، نگهداری کرد.
قبل از انجام کشت بهتر است ظرف حاوی نمونه را تکان داده تا از ته نشین شدن باکتری ها جلوگیری شود. برای کشت دادن نمونه باید از لوپ کالیبره استفاده کرد. باید توجه داشت که لوپ مورد استفاده هیچ گونه بازشدگی از ناحیه اتصال نداشته باشد زیرا ضریب رقت آن تغییر می کند. ضریب رقت لوپ عددی بسیار مهم است زیرا تعداد کلنی که در سطح پلیت رشد می کند(در صورتی که کشت خالص باشد) در آن ضرب شده و عدد حاصله تحت عنوان CFU در میلی لیتر گزارش می شود.(CFU/ml)
پلیت های کشت داده شده بعد از 18 تا 48 ساعت مورد بررسی قرار می گیرند. در ابتدا، وظیفه یک میکروبیولوژیست مشخص کردن کشت های خالص از یک آلودگی احتمالی و تجسس هویت باکتری هاست.

تفسیر نتایج کشت ادرار:
1 .1 شمارش کلنی های کمتر از 104 غیر از موارد استثنا که در زیر به آ نها اشاره می شود اهمیت زیادی ندارد و معمولاً منفی گزارش می گردد.
2 .2 شمارش کلن یهای کمتر از 102 معمولاً منفی تلقی می گردد.
3 .3 شمارش کلنی های بیشترا ز 102 در کودکانی کها درار آنها به روش سوپراپوبیک جمع آوری شده باشد،
باارزش بوده و باید هویت باکتری شناسایی و تست حساسیت ضدمیکروبی در مورد آنها انجام شود .
4 .4 شمارش کلنی های بیشتر از 103 در مردان دارای علامت و در موارد پروستاتیک به ویژه اگر نمونه به روش سوندگذاری مستقیم، جمع آوری شده باشد و همچنین در صورتی که کشت باکتری ها به صورت خالص باشد، باارزش بوده و باید مورد بررسی قرار گیرد.
5 .5 شمارش کلنی بین 105 - 104 در افراد بدون علامت با کشت های خالص، نمونه مشکوک تلقی م یگردد و توصیه می شود که نمونه مجدداً تکرار شود.
6 .6 شمارش کلنی بیش از 105 حتی در غیاب علائم، نشا ندهنده عفونت واقعی است و باید باکتری موردنظر شناسایی و تست حساسیت ضدمیکروبی در مورد آن ها انجام گردد.
مشاهده بیش از 3 نوع کلنی از باکتری های مختلف معمولاً نشا ندهنده آلوده شدن محیط کشت می باشد که بهتر است نمونه مجدداً درخواست شود.
برای تعیین هویت کلنی ها (باکتری) مراحل زیر صورت می گیرد:
محیط بلاد آگار و محیط EMB از نظر رشد کلنی مورد بررسی قرار می گیرد. از آنجا که در آزمایشگاه تشخیص طبی، رنگ آمیزی گرم به صورت روتین انجام نمی شود، بنابراین اگر باکتری تنها در محیط
بلاد آگار رشد کرد، گرم مثبت بوده و اگر در هر دو محیط رشد کرد، گرم منفی می باشد البته انتروکو کها نیز می توانند به صورت خیلی ضعیف در روی محیط EMB رشد کنند.
در این مقاله سعی شده است که باکتری های گرم مثبت مورد بررسی قرار گیرند. باکتری های گرم مثبت شامل کوکسی ها و باسیل ها می باشند که ابتدا به کوکسی های گرم مثبت می پردازیم. کوکسی های
گرم مثبت مجموعه ای ناهمگن از باکتری ها می باشند که خصوصیات مشترک آنها عبارتند از :
1 .1 کروی بودن
2 .2 رنگ آمیزی گرم مثبت
3 .3 عدم وجود اندوسپور

شکل 1. انواع باکتری های گرم مثبت

اولین آزمایش برای تشخیص کوکسی ها گرم مثبت، انجام تست کاتالاز می باشد این تست استافیلوکوک ها را از استرپتوکو کها جدا می کند. استافیلوکوک ها کاتالاز مثبت و استرپتوکوک ها کاتالاز منفی هستند.

استافیلوکوک ها:
استافیلوکوک ها (استافیلو به معنای خوشه انگور) شامل کوکسی های گرم مثبت 5/ 1- 5/ 0 میکرومتری هستند که معمولاً به صورت گروه های نامنظمی یافت می شوند که بین آن ها کوکسی های دوتایی یا چهارتایی نیز وجود دارد. اعضای این گروه بی هوازی اختیاری، غیرمتحرک و غیراسپورزا هستند. استافیلوکوکها روی پوست، درون دهان، مجرای فوقانی تنفسی به صورت کومنسال وجود دارند و می توانند در بدن ایجاد بیماری کنند.
سه گونه مهم از استافیلوکو کها که در آزمایشگاه بالینی پراهمیت هستند:
1 .1 استافیلوکوکوس اورئوس (طلایی)
2 .2 استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (پوست خارجی)
3 .3 استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس (ساپروفیتیکوس از واژه ساپروفیتیک )عاملی که روی بافت مرده رشد می کند( گرفته شده است که ساپروس به معنای فاسد و فایتون به معنای گیاه است).
4 .4 در آزمایشگاه بالینی از تست مانیتول سالت آگار و Dnase و تست های دیگر جهت تمایز گونه های بیماری زای استافیلوکوک ها استفاده می شود. S.aureus به عنوان یک عامل مهم بیماری زا در
انسان است که مهم ترین عامل مسمومیت های غذایی و همچنین عامل استئومیلیت، پنومونی های باکتریایی و بیماری های دیگر است. همه ی سویه های بیماریزای S.aureus کوآگولاز مثبت هستند درحالی که گونه های دیگر استافیلوکوکی، کوآگولاز منفی می باشند؛ در واقع  کوآگولاز با محصور کردن باکتریهای تولیدکننده آن و ایجاد لخته، باکتری ها را در مقابل آنتی بادی و فاگوسیتوز شدن توسط فاگوسی تکننده ها حفظ می کند و بیمار یزایی آن ها را افزایش میدهد.

همه انسان ها روی پوستشان استافیلوکوک های کوآگولاز منفی دارند. کلونیزاسیون موقت استافیلوکوک اورئوس در مناطق چی ندار مرطوب پوست امری رایج است؛ همچنین کلونیزاسیون استافیلوکوک اورئوس در نواحی بند ناف پوست و پرینه نوزادان امری رایج است .
از آنجایی که استافیلوکوک ها روی پوست و در نازوفارنکس یافت می شوند، انتشار باکتری رایج بوده و عامل بروز عفون تهای اکتسابی بیمارستانی می باشند.

:S.aureus

کلنی های صاف و بزرگ از مشخصات این باکتری می باشد. در صورت رشد استافیلوکوک اورئوس روی محیط بلاد آگار، گلبول های قرمز ب هدلیل تولید آلفاتوکسین متلاشی می شوند و همولیز β ایجاد می کنند.

شکل 2. نمایی از باکتری S.aureus

رنگ زرد اطراف کلنی های S.aureus به دلیل تخمیر قند مانیتول می باشد ولی در استافیلوکوک اپیدرمیدیس به دلیل عدم توانایی تخمیر قند مانیتول، اطراف کلنی ها رنگ زرد ایجاد نمی شود. این تست در استافیلوکوک ساپروفیتیکوس متغیر است.

 

برای تشخیص استافیلوکوک اورئوس از سایر استافیلوکوک ها می توان از تست کوآگولاز استفاده کرد. اگر تست کوآگولاز مثبت شد باکتری استافیلوکوک اورئوس می باشد.  اگر تست کوآگولاز منفی شد باکتری استافیلوکوک اپیدرمیدیس و یا استافیلوکوک ساپروفیتیکوس می باشد. برای تشخیص قطعی استافیلوکوک اورئوس از روش های زیر استفاده می شود:

•  کشت روی محیط مانیتول سالت آگار

•  تست Dnase

•  تست حساسیت به باسیتراسین 4% واحدی و فورازولیدون 100 میکروگرم

:S.epidermidis
یک گونه ی غیربیمار یزا از جنس استافیلوکو کها می باشد که فلور طبیعی پوست انسان بوده و به نووبیوسین حساس است. کلنی های مات، سفید، مدور و بزرگ بدون همولیز از مشخصات این باکتری می باشد.

 

شکل 3. نمایی از باکتری S.epidermidis

:S.saprophyticus
این باکتری مولد عفونت مجاری ادراری، مخصوصاً در زنان است که به نووبیوسین مقاوم است.

 

 

شکل 4. نمایی از باکتری S.saprophyticus

استرپتوکوک ها:
استرپتوکوک ها کوکسی های گرم مثبتی هستند که مانند زنجیر به دنبال هم قرار می گیرند. کاتالاز منفی اند و در شرایط بی هوازی بهتر رشد می کنند و واکنش های همولیتیکی بهتری را نشان می دهند.
برخی روی محیط بلاد آگار باعث لیزشدن گلبول های قرمز می شوند. بسیاری از استرپتوکوک ها پاتوژن های مهم انسان هستند که به دلیل وجود سه الگوی مختلف همپوشان، متأسفانه طبقه بندی گونه ها در این جنس، دشوار است.
طبقه بندی استرپتوکوک ها معمولاً بر اساس تولید همولیزین روی محیط بلاد آگار است.
Β همولیتیک: همولیزین محلول تولید می کنند و معمولاً منطقه ای شفاف و مشخص اطراف کلنی ایجاد م یکنند مانند استرپتوکوک پیوژنز
Α همولیتیک: همولیزین محلول تولید نمی کنند و منطقه ای نیمه شفاف و سبزرنگ اطراف  کلنی ها ایجاد م یکنند مانند استرپتوکوک ویریدانس

گاما همولیتیک (بدون همولیز): تغییر قابل مشاهده ای را طی رشد روی محیط بلاد آگار ایجاد نمی کنند.
البته استرپتوکوک ها بر اساس خاصیت آنتی ژن هم مورد بررسی قرار گرفته اند که بر اساس این طبقه بندی که لانسفیلد نامیده می شود، استرپتوکوک ها به گروه های C ,B ,A … تقسیم می شوند.
وظیفه عمده ی یک باکتریولوژیست این است که مشخص کند استرپتوکوک بتا همولیتیک رشد کرده در محیط کشت، استرپتوکوک پیوژنز گروه A است یا جزء گروه دیگری از استرپتوکوک هاست، زیرا استرپتوکوک پیوژنز گروه A خاصیت پاتوژنی بیشتری نسبت به سایر گرو ههای استرپتوکوکی دارد. نمونه های مورد آزمایش می توانند نمونه گلو، بینی، سوا بهایی از واژن در موارد تب زایمانی، چرک (عفونت چرکی) یا خون (عفونت خون) باشند.

تشخیص باکتری:
ابتدا پلیت موردنظر را از نوع همولیز ایجادشده بررسی می کنند. در موارد ایجاد آلفاهمولیز، به دو گروه ویریدانس و پنوموکک مشکوک و در صورت ایجاد β همولیز، به گروه A و B مشکوک می شویم. البته
این روش زیاد نیز دقیق نیست، چون بعضی از باکتری های β همولیتیک مثل آگالاکتیه، همولیز  β واضح نشان نمی دهند، بنابراین می توان از تست حساسیت به SXT (سولفامتوکسازول و تر یمتوپریم)  استفاده کرد که در این تست، گروه A و B به SXT مقاوم بوده ولی سایر گروه ها حساس اند.

گروه A (پیوژنز):
 کاتالاز منفی
 حساس به باسیتراسین
 توانایی هیدرولیز PYR

گروه B (آگالاکتیه):
معمولاً به صورت سپتیسمی و مننژیت در نوزادان تظاهر می یابد که منبع عفونت بیش تر مادر نوزاد می باشد. همانطور که قبلاً گفته شد، گروه B همولیز واضحی همانند گروه A، نشان نمی دهند و گاهی اوقات نیز همولیز آلفا ایجاد می کنند و در برخی موارد گاما همولیتیک هستند.برای تشخیص قطعی استرپتوکو کهای گروه B م یتوان از رو شهای زیر استفاده کرد:

•  تست CAMP

•  تست هیدرولیز هیپورات سدیم

تست CAMP:

برای شناسایی احتمالی گروه B صورت می گیرد. تست CAMP مخفف نام افرادی است که این تست را برای نخستین بار ابداع کردند که شامل Christie-Atkins-Munch-Petersen می باشد.

 

شکل 5. نمایی از تست CAMP

این آزمایش به سه روش انجام می شود:
1 .1 استفاده از سوش های S.aureus تولیدکننده بتا همولیزین
2 .2 دیسک های حاوی بتا همولیزین
3 .3 بتا همولیزین استخراج شده از استافیلوکوک اورئوس
همولیز بتا، در محلی که دو سویه استاف اورئوس و استرپتوکوک گروه B به هم نزدیک می شوند، تشدید می شود و شبیه به نوک پیکان دیده می شود و در این صورت تست CAMP مثبت می شود.
روش سوم به این صورت است که اگر یک قطره از بتا همولیزین استخراج شده از استافیلوکوک اورئوس، روی محیط کشت استرپتوکوکی ریخته شود، بعد از 20 دقیقه انکوبه کردن در دمای 37
درجه سانت یگراد، شدت همولیز به خوبی قابل مشاهده می گردد.

هیدرولیز سریع هیپورات سدیم:
این باکتری می تواند هیپورات سدیم را هیدرولیز کرده و اسید بنزوئیک و گلیسین تولید کند. گلیسین توسط عامل اکسیدکننده ای به نام نین هیدرین، دی آمینه شده، احیا می شود و تولید رنگ بنفش می کند .
استرپتوکوک ویریدانس  :(strep.viridans)
اکثر باکتری های این گروه همولیز ناقص روی پلیت بلاد آگارایجاد می کنند(آلفا همولیتیک). فلور طبیعی دهان و حلق هستند و به علت ارتباط آن ها با عفونت دندان وآندوکاردیت باکتریایی حاد، اهمیت کلینیکی ویژه ای دارند. این باکتر یها در خون، زخم های بسته و آبسه ها نیز یافت می شوند.

 

منابع:

• کن. اس روزنتال، محمدمهدی سلطان دلال، پاتر کی آر موری، ما کیل فالر، میکروب شناسی پزشکی مورای (باکتری شناسی عمومی - اختصاصی)، مترجمان: جلال مردانه، زهرا پاکباز،اندیشه رفیع، 1392 .

• براتی، بابک، دستور کار آزمایشگاه میکروب شناسی، کتابخانه دانشکده داروسازی کرمان، تهران:جعفری، 1390 .

• کتاب راهنمای کارآموزی دانشجویان علوم آزمایشگاهی