تشخیص مالاریا

 تشخیص مالاریا توسط میکروسکوپ معمولی روش استاندارد طلایی برای تشخیص مالاریا باقی مانده است و ارزان و قابل اعتماد می باشد.تستهای تشخیصی سریع، گران قیمت بوده ولی سریع و راحت هستند. تستهای سرولوژیکی برای تشخیص عفونت مالاریا بر اساس شناسایی آنتی بادی های تولیدشده علیه مراحل غیرجنسی خونی ازانگل مالاریا استوار می باشند.
روش سرولوژی بهترین روشی است که به عنوان یک ابزار اپیدمیولوژیک استفاده می شود و مناسب برای تشخیص مالاریای حاد نیست. تکنیک های مولکولی بهتر است در آزمایشگاه های تحقیقاتی مناسب، گسترش مقاومت به دارو و عود را بررسی نمایند و می توانند برای شناسایی گونه ها در زمانی که تعداد انگل بسیار کم است و یا در برخی از نمونه ها که در معرض از بین رفتن قرار گرفته اند مفید باشند .

روشهای تشخیص آزمایشگاهی مالاریا

1 - مشاهده مستقیم میکروسکوپی نمونه خون
ساده ترین راه تشخیص انگل، مشاهده مستقیم میکروسکوپی نمونه خون برای دیدن انگل مالاریا بوده که هنوز استاندارد طلایی برای تشخیص مالاریا است. تشخیص میکروسکوپی مالاریا توسط رنگ آمیزی گسترش خون ضخیم و نازک روی اسلاید شیشه ای به دیدن انگل مالاریا منجر می شود.

روش نمونه گیری

1 - تهیه اسمیر خونی مستقیم
انگشت بیمار با الکل تمیز، بعد خشک می شود.
در سمت نوک انگشتان با یک لانست استریل نوکتیز و یا سوزن، دو قطره خون بر روی یک لام شیشه ای قرار داده می شود.
برای تهیه یک اسمیر خونی ضخیم، یک قطره خون در یک حرکت دایره ای با گوشه ای از لام هم زده می شود. باید مراقب بود تا هنگام آماده سازی، نمونه بیش ازحد ضخیم نباشد و نیز باید اجازه دهیم تا بدون افزودن مواد ثابت کننده، خشک گردد. ازآنجاکه گلبول های قرمز فیکس نشده اند با استفاده از قطره آب لیز می شوند.

شکل 1- مراحل تهیه گستر شهای خونی ضخیم و نازک از خون محیطی

برای تهیه اسمیر خونی نازک بلافاصله با لبه صاف از یک لام دیگر قطره خون را با زاویه  45 درجه بین لام و سطح قطره بهم می زنیم و سپس لکه خون را با حرکات رفت وبرگشت سریع و یکنواخت در امتداد سطح لام تهیه می کنیم.

اسمیرها باید در مقابل هوا خشک شده و با متانول فیکس گردند. از آنجا که حجم زیادی از خون روی گسترش ضخیم قرار می گیرد، بنابراین گسترش ضخیم خیلی حساس تر از گسترش نازک است .

شکل 2- اسمیر خونی نازک ( A) و ضخیم(B) از خون محیطی برای تشخیص مالاریا

2 - تهیه اسمیر داخل جلدی
یکی دیگر از روش های تشخیص عفونت با مالاریا اسمیر داخل جلدی است که به وسیله سرسوزن اندازه 25 سوراخ های باریکی در روی ساعد دست ایجاد می کنند. نباید از سوراخ خون تراوش کند ولی خونابه سرمی تحت تأثیر فشار روی یک لام شیشه ای قرار داده شده و اجازه می دهند تا در معرض هوا خشک شده و سپس با متانول فیکس می نمایند. این اسمیر ممکن است لکوسیت های حاوی رنگدانه را نشان داده و نیز اشکال بالغ تری از پلاسمودیوم فالسیپاروم را مشخص می کند.
روش های رنگ آمیزی برای تشخیص مالاریا:

• رنگ آمیزی گیمسا به مدت 30 - 20 دقیقه

• رنگ آمیزی لیشمن به مدت 45 دقیقه

• روش سریع صحرایی به مدت 10 ثانیه

• نتایج و تفسیر مشاهدات میکروسکوپی

با استفاده از میکروسکوپ های نوری تعداد باندهای خونی، گون هها و مراحل مرفولوژیکی از انگل گزارش شده است. گاهی اوقات انگل ها در گستره خون محیطی بیماران مبتلا به مالاریا یافت نمی شوند، اما رنگدانه مالاریا ممکن است در چرخه فاگوسیتوز در لکوسی تها دیده شود، این یک نشانه شاخص از عفونت جدید مالاریا است و در مورد عفونتی که درمان کامل یا نسبی شده در غیاب انگل مشاهده می گردد.
حضور رنگدانه در لکوسیت از نظر کمی و کیفی با بار انگل در ارتباط است و بنابراین نشان دهنده یک عفونت بالینی قابل توجه به ویژه در مناطقی است که انتقال بیماری کم است.  زمانی که در اسمیر نازک از خون محیطی انگل وجود ندارد، ممکن است در آسپیراسیون مغز استخوان یافت شود.
 اسمیر خون علاوه بر تشخیص مالاریا می تواند به لحاظ پیش آگهی بیماری هم اطلاعات مفیدی را ارائه دهد؛ تعداد انگل، تعداد فاگوسیت های حاوی رنگدانه و وجود اواخر مرحله غیرجنسی انگل همگی با پیش آگهی مرگبار بیماری رابطه مستقیم دارند.

شکل 3- اشکال مختلف زیستی 4 گونه انگل مالاریا

2 - رو شهای مولکولی
تکنیک های مولکولی بهتر است در آزمایشگاه های تحقیقاتی مناسب، گسترش مقاومت به دارو و عود را بررسی نمایند و می توانند برای شناسایی گونه ها در زمانی که تعداد انگل بسیار کم است و یا در برخی از نمونه ها که در معرض از بین رفتن قرار گرفته اند، مفید باشند.
•واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR ) اجازه می دهد تا قسمت خاصی از یک منطقه انتخاب شده از ژنوم مالاریا تکثیر یابد. این روش بسیار اختصاصی و حساس است و قادر به تعیین ژنوتایپ می باشد .
•علاوه بر این آنالیز، استفاده از ( PCR (SNP تشخیص انگل هایی مقاوم به دارو و نیز عفونتهای مخلوط را ممکن می سازد، بااین حال PCR گران بوده و نیازمند یک آزمایشگاه پیشرفته همراه با کارکنان مجرب و دوره دیده است.

3- روش بافی کوت کمی (Quantitative buffy coat method)
این روش شامل رنگ آمیزی لایه سلول های قرمز سانتریفوژشده و فشرده کردن با آکریدین نارنجی تحت یک منبع نور ماوراءبنفش می باشد که یک روش برای شناسایی انگل مالاریا در خون محیطی است و از لحاظ حساسیت شبیه به روش میکروسکوپی اسلاید خون ضخیم معمولی است و باید همراه با گسترش ضخیم خون برای غربالگری استفاده شود و طی مراحل زیر انجام می گردد:
•خون از طریق سوراخ کردن انگشت در یک لوله هماتوکریت حاوی آکریدین نارنجی و ضدانعقاد جمع آوری می گردد.
•لوله هماتوکریت را در دور 12000 در مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ می کنند.
• بلافاصله با استفاده از میکروسکوپ مجهز به یک منبع نور UV مورد بررسی قرار می دهند. هسته انگل به رنگ فلورسانس سبز روشن و سیتوپلاسم آن به رنگ زرد نارنجی مشاهده می شود.

شکل 4- روش بافی کوت نیمه کمی ( QBC ) برای تشخیص انگلهای مالاریا

4 - روش های سرولوژی
تست های سرولوژیکی برای تشخیص عفونت مالاریا بر اساس شناسایی آنتی بادی های تولیدشده علیه مراحل غیرجنسی خونی از انگل مالاریا استوار می باشند. روش سرولوژی بهترین روشی است که به عنوان یک ابزار اپیدمیولوژیک استفاده می شود و مناسب برای تشخیص مالاریای حاد نیست.
روش ایمونوفلورسانس غیرمستقیم (IFA)
اولین آزمون سرولوژیکی مورد استفاده برای تشخیص آنتی بادی مالاریا می باشد.
 در این روش از آنت یژن ویژه و یا آنتی ژن خام آماده متصل شده درروی یک اسلاید که در دمای 30- درجه سانتی گراد تا زمان آزمایش نگه داشته شده است، استفاده می شود و به روش کمی هر دو آنتی بادی IgG و IgM در نمونه های سرم بیمار را بررسی می کنند.
• تیتر بالاتر از 1:20 مثبت و آنهائ یکه کمتر از 1:20 هستند مشکوک و یا با اهمیت کم طبقه بندی می شوند.
• تیترهای بالاتر از 1:20 دلیل محکمی بر عفونت جدید می باشد.
•تست های سرولوژی عفونت مالاریای سابق یا سابقه عفونت را تأیید می کنند و در بررسی های اپیدمیولوژی و غربالگری نمونه های خون جمع آوری شده برای بانکهای خون مفید هستند.
• ابزارهای لازم برای روش های سرولوژیکی جهت تشخیص عفونت حاد مالاریا محدود بوده و با توجه به تأخیر در تولید آنتی بادی ها، عدم تأیید گونه و نیاز به میکروسکوپ فلورسنس (UV) مشکل است.

5- کشت انگل مالاریا
از روش های دیگر تشخیصی بیماری مالاریا می توان به کشت انگل مالاریا به صورت زنده و تشخیص پس از مرگ از طریق تشخیص انگل های مالاریا و یا مشاهده رنگدانه در لوکوسیت ها در کالبدشکافی از طریق بیوپسی بافت ها از نمونه مغز، طحال و اسمیر نازک استخوان اشاره کرد.

6 - روشهای سریع
تشخیص آنتی ژن های انگل مالاریا در نمونه های انسانی مالاریا، نظیر هیستیدین غنی از پروتئین2(HRP-II ) یا لاکتات دهیدروژناز پلاسمودیوم ( pLDH ) را می توان با آزمایش سریع point-of-care که بر اساس روش ایمونوکروماتوگراف می باشد، انجام داد.
مزایای استفاده از این تست ها سریع بودن و حساسیت بالای آنها است. معایب آن ها نیز هزینه نسبتاً بالا، عدم کارایی کافی در تشخیص بعضی از گونه های مالاریا و تنوع زیاد محصولات آنها می باشد. تست های بر پایه تشخیصی HRP II نتایج مثبت در فاز نقاهت بیماری به دلیل باقی ماندن HRP II در خون بعد از پاک شدن انگل را ارائه می کنند.

 

ReferencesWorld Health Organization Expert Committee Report on Malaria: 20th Report; 2000. World Health Organization, Geneva, Switzerland.
. Gilles HM, Warrell DA. Diagnostic methods in malaria. In: BruceChwatt’sEssential Malariology, 3rd ed., 1993. Edward Arnold; 78- 95.
World Health Organization. Basic malaria microscopy. Geneva, Switzerland, 1991, 67-8.
. Silamut K, White NJ. Relation of the stage of parasite development in the peripheral blood to prognosis in severe falciparum malaria. Trans R Soc Trop Med Hyg 1993; 87: 436-43.
 White NJ, Silamut K. Rapid diagnosis of malaria. Lancet 1989; 8635: 435.
. Nguyen PH, Day N, Pram TD, Ferguson DJ, White NJ. Intraleucocytic malaria