امروزه لوله های آزمایشگاهی شیشه ای به دلیل چندبار مصرف بودن، قابلیت شکستن و قدرت القاء لخته به خون، کمتر مورد استفاده قرار گرفته و به جای آن لوله های پلاستیکی یا سیلیکون تجاری به بازار آمده اند که حتی در دورهای بالای سانتریفیوژ هم شکسته نشده و به دلیل داشتن درب پلاستیکی از خطر آلوده کنندگیِ به مراتب کمتری برخوردار هستند.

برخی لوله های پلاستیکی فاقد ضدانعقاد بوده و برای گرفتن نمونه لخته مورد استفاده قرار می گیرند ولی چون شیشه ای نیستند، مدت زمان زیادی را برای لخته شدن کامل و جدا شدن سرم شفاف و بدون فیبرین نیاز دارند. این لوله ها اغلب درب قرمز دارند که گاهی در ته خود حاوی ساچمه های پلاستیکی آغشته به مواد ترومبوژن (محرک انعقاد) بوده و باعث لخته شدن سریع خون می شوند. از مواد ترومبوژن می توان به ترومبین (یا فاکتور )II اشاره نمود.

لوله هایی که فقط حاوی فعال کننده ترومبین هستند، درب نارنجی داشته و برای انجام اورژانسی تست های بیوشیمی مورد استفاده قرار می گیرند. این لوله ها هرگز برای بررسی های هماتولوژی کاربردی نداشته و فقط برای سنجش مقادیر بیوشیمی (آهن، TIBC ، فولات، B12 ، بیلی روبین و ...) سرولوژی، ایمونولوژی و دیگر پارامترها به کار گرفته می شوند.

RBC ها به دلیل چگالی بیشتری که نسبت به دیگر سلولها و عوامل مختلف خون دارند، سانتریفیوژ در ته لوله جمع شده و پلاسما یا سرم در روی آن قرار می گیرد. گاهی برای جداسازی بهتر و راحت تر سرم، به تهِ لوله های آزمایش ژل مخصوصی اضافه می شود که چگالی کمتر از RBC ها و بیشتر از سرم دارد، لذا بعد از نمونه گیری و سانتریفیوژ خون، RBC ها در زیر ژل و سرم در روی ژل قرار می گیرد. این نوع لوله ها درب طلایی رنگ داشته و به لوله های SST یا لوله های جداکننده سرم نیز معروف هستند. این لوله ها دارای مزایای زیادی نسبت به لوله های ساده می باشند. این نوع لوله ها به جهت کاهش زمان آماده سازی نمونه ی خون برای انجام آزمایش های بالینی و جداسازی کامل و مؤثر سرم خون از سلول های خونی به طور گسترده در آزمایشگاه های بالینی مورد استفاده قرار می گیرد. لوله هایی با درب زرد و سیاه نیز وجود دارند که حاوی مواد نگهدارنده و مغذی جهت زنده نگه داشتن میکروارگانیسم ها هستند.
به منظور ارزیابی های مورفولوژیک سلول های خونی و نیز شمارش آنها، می بایست نخست از لخته شدن نمونه خون جلوگیری نمود که ضدانعقادها چنانچه از نامشان پیداست، برای همین منظور بکار گرفته می شوند. در ادامه پس از ارزیابی مفصل لوله های جمع آوری خون، به طور کامل به مبحث ضدانعقادهای مورد استفاده در این لوله ها (هپارین، EDTA و ...) می پردازیم.

معرفی روش های جمع آوری خون

سیستم های مختلفی می توانند به منظور جمع آوری نمونه های خون برای آزمایش های بالینی مورد استفاده قرار بگیرند که مهمترین آنها سیستم های جمع آوری خون خلأ و سیستم های غیرخلأ یا سرنگ ها می باشند. اگرچه در حال حاضر سیستم های جمع آوری خون غیرخلأ به گستردگی سیستم های خلأ مورد استفاده قرار نمی گیرند، اما هنوز هم یک روش مهم برای جمع آوری خون می باشند. در این روش از سرنگ ها برای جمع آوری خون از افراد و سپس انتقال آن به لوله های آزمایش مختلف استفاده می شود (شکل1)

شکل ۱. استفاده از سرنگ ها برای جمع آوری

در سال های اخیر لوله های جمع آوری خون خلأ جایگزین سرنگ ها شده اند و در حال حاضر نیز به طور گسترده ای در محیط های بالینی و تحقیقاتی استفاده می شوند. اولین لوله خلأ توسط Joseph Kleiner اختراع شد.
سیستم های خلأ شامل یک سوزن، یک نگهدارنده به عنوان تکیه گاه سوزن و یک یا چند لوله خلأ با درپوش های رنگی برای مشخص کردن نوع لوله می باشند. فشار هوا در داخل این لوله ها بسیار پایین و کمتر از محیط عادی است و در نتیجه خلأ نسبی موجب تسهیل کشیدن حجم معینی از خون می شود. در این روش پس از قرار دادن سوزن در داخل رگ، لوله در نگهدارنده فشار داده می شود، به طوریکه انتهای دیگر سوزن، درپوش لوله را سوراخ می کند (شکل 2). اختلاف فشار بین داخل لوله و رگ باعث پر شدن لوله از خون می شود (شکل 3). پس از پر شدن لوله، آن را از نگهدارنده خارج می کنند و در صورت نیاز، بدون خارج کردن سوزن از رگ، لوله دیگری را داخل نگهدارنده قرار می دهند. سیستم های خلأ امکان جمع آوری نمونه های خون متعدد را با یک بار سوراخ کردن رگ فراهم می کنند، بنابراین علاوه بر اینکه موجب سهولت استفاده، سرعت و دقت می شوند، هنگامی که نمونه های متعددی نیز مورد نیاز است می توانند بسیار راحت تر از سرنگ تغییر داده شوند و از این رو خطر ریختن و آلوده شدن نمونه ها کاهش میی‌ابد و ایمنی بیشتری را فراهم می کنند. به طور کلی در هر دو سیستم خلأ و غیرخلأ باید از لوله های جمع آوری خون مناسب با هر آزمایش که می توانند شامل افزودنی های متفاوتی باشند، استفاده گردد.

شکل ۲. اجزای سیستم خلأ

شکل ۳. جمع آوری خون با استفاده از لوله خلأ
 

اجزای لوله های جمع آوری خون

لوله های جمع آوری خون به طور کلی شامل مواد دیواره لوله، سورفکتانت و درپوش لاستیکی هستند و بر اساس نوع لوله که با رنگ درپوش آن مشخص می شود، می توانند حاوی افزودنی های مختلفی نیز باشند (شکل 4). افزودنی های موجود در لوله های جمع آوری خون ممکن است یک ضدانعقاد برای جلوگیری از لخته شدن خون، یک ماده شیمیایی برای کمک به حفظ خون یا یک ماده برای تسریع فرآیند لخته شدن (فعالکننده لخته) باشند. همچنین همانطور که پیش تر هم اشاره شد، بعضی از لوله ها شامل ژلهایی هستند که به عنوان یک مانع بین لخته یا سلولهای خونی و سرم یا پلاسما عمل می کنند.

شکل ۴. اجزای یک لوله جمع آوری خون

انواع لوله های جمع آوری خون

آزمایش های مختلف بالینی به نمونه های متفاوتی از خون (سرم، پلاسما و خون کامل) نیاز دارند، بنابراین با توجه به نوع نمونه ی مورد نیاز، لوله های جمع آوری خون نیز حاوی افزودنی های متفاوتی (ژل جداکننده، فعا لکننده ی لخته و ضدانعقاد) می باشند. در این نوع از لوله ها، افزودنی موجود در هر لوله با رنگ درپوش آن مشخص می شود. تعدادی از انواع مختلف لوله های جمع آوری خون و کاربرد هر یک از آنها در جدول ۱ ارائه شده است. همانطور که مشاهده می شود نوع افزودنی موجود در هر لوله با رنگ درپوش آن لوله مشخص می گردد.

جدول ۱. انواع لوله های جمع آوری خون و افزودنی های موجود در آنها

 

ضدانعقادهای مورد استفاده در لوله های جمع آوری خون

 

1. هپارین

برای جلوگیری از انعقاد خون، مقدار ۱۰ تا ۲۰ واحد معادل 0.2 mg/ml - 0.1 هپارین HMWH به ازای هر میل یلیتر خون استفاده می شود. این ضدانعقاد که ساختمان موکوپلی ساکارید دارد پس از ترکیب با آنتی ترومبین III (مهارکننده فیزیولوژیک اصلی ترومبین و فاکتور Xa) آنها را غیرفعال نموده و مانع لخته شدن خون می شود. آنتی ترومبین III با این مکانیسم می تواند فاکتورهای ، XIIa XIa و IXa را نیز تاحدودی مهار کند. درواقع دایمر AT-III و هپارین با ترومبین کمپلکس سه تایی  با نسبت ۱:۱:۱ ایجاد نموده و بدین ترتیب، ترومبین (و دیگر فاکتورهای مذکور) را از نظر آنزیمی غیرفعال می سازند.
در حضور هپارین، سرعت واکنش بین ترومبین و آنتی ترومبین III حدود ۲۰۰۰ برابر افزایش می یابد. لازم به ذکر است که AT-III برای مهار ترومبین به هپارین های بلند HMWH نیاز داشته ولی برای مهار فاکتور X حضور هپارین های کوتاه و حتی پنتاساکارید نیز کفایت می کند. این در حالی است که قدرت مهار ترومبین در این دو هپارین بسیار پایین است، ازاین رو برای کنترل و پایش درمانی HMWH از تست aPPT و برای پایش درمانی هپارین های LMWH و فونداپارینوکس از تست Anti-X-assay یا AXA استفاده می شود. نکته دیگر اینکه به منظور خونگیری همواره از هپارین HMWH به عنوان ضدانعقاد استفاده می شود چراکه این نوع هپارین از روده، ریه و احشاء حیواناتی مثل گاو، گوسفند و خوک تهیه شده و ارزان قیمت هستند.

 

.2 اگزالات پتاسیم- اگزالات آمونیوم

این ضدانعقاد پس از ترکیب با یون کلسیم موجب رسوب و دیونیزه شدن آن شده و از شروع روند انعقاد، اگریگاسیون پلاکت ها و اتصال فاکتورهای انعقادی به سطح پلاکت ها جلوگیری می کند. برخلاف EDTA که باعث شیلاته کردن- Chelating و جذب کلسیم به خود می شود، اگزالات، یون کلسیم را به رسوب غیرمحلول تبدیل می کند. هرچند در آزمایش HCT ،ESR و شمارش گلبول ها می توان از این ضدانعقاد با مقدار کم استفاده نمود ولی از آنجا که باعث تغییر فاحشی در مورفولوژی اریتروسیت ها و لکوسیتها می شود، جهت ارزیابی های مورفولوژیکی این سلول ها مناسب نبوده و در تست CBC به کار نم یرود. دوز مصرفی اگزالات 1-2 mg/ml است. این ترکیب می بایست قبل از مصرف در فور ۶۰ درجه یا انکوباتور خشک شود تا باعث ایجاد رقت کاذب نشود. حرارت بالا مثل دمای ۱۰۰ درجه باعث تبدیل اگزالات به بی کربنات می شود و از این رو نباید از دمای بالا برای این منظور استفاده شود. گاهی ترکیب اگزالات پتاسیم و فلورید سدیم با هم بکار می روند (لوله های درب خاکستری) که فلورید با مهار آنزیم های گلیکولیز (آنزیم انولاز) مانع از مصرف و افت قند خون نمونه تا ۵ روز می شود. این لوله به طور خاصی برای نمونه CSF نیز به کار می رود تا از کاهش کاذب گلوکز آن جلوگیری به عمل آورد. خود فلورید سدیم به تنهایی خاصیت ضدانعقادی نیز دارد و ۱ میلی گرم آن از انعقاد ۱ میل یلیتر خون جلوگیری می کند. در برخی از منابع عنوان شده است که اگزالات جامد به دلیل افزایش املاح خون، ایجاد شرایط هیپرتونیک و از دست دادن مقداری آب از گلبول های قرمز، می تواند باعث کاهش ۸ تا ۱۳ درصدی هماتوکریت شود.
همانطور که اشاره شد، اگزالات ها به صورت ترکیب با سدیم، پتاسیم و آمونیوم به کار گرفته می شوند که از میان آنها اگزالات پتاسیم و آمونیوم از کاربرد بیشتری برخوردار هستند و در بسیاری از موارد از ترکیب هر دوی آنها استفاده می شود که به آن اگزالات دوبل گفته می شود.

3. سیترات تری سدیم %

3.2
سیترات سدیم با اتصال به کلسیم و شلاته کردن آن عمل ضدانعقادی خود را انجام می دهد. سیترات سدیم به دلیل پایدار ماندن فاکتورهای انعقادی V و VIII در آن، ضدانعقاد سفارش شده و انتخابی برای آزمون های انعقادی مثل RT ،TT ،PTT ،PT و PFA-100 می باشد که با نسبت ۱ به ۹ با خون مخلوط می گردد.
لوله های تجاری با درب آبی (ونوجکت یا خلأ) یا بنفش پررنگ (لوله معمولی) جهت نمونه برداری به منظور تست های انعقادی فوق الذکر و تست های سنجش فاکتورهای انعقادی طراحی شده اند که حاوی 0.2ml سیترات سدیم بوده و خون نیز تا خط سیاهی که در کل، حجم 2ml را نشان می دهد. به لوله ریخته می شود. سیترات سدیم کارایی پلاکت ها را حفظ نموده و از این رو جهت مطالعه عملکرد پلاکت ها نیز مورد استفاده قرار می گیرد. این ضدانعقاد نیز باعث تجمع سلولی می شود و به همین دلیل ضدانعقادی مناسب جهت آزمون شمارش سلولی یا CBC به شمار نمی رود. مایع بودن سیترات سدیم نیز باعث شده تا به جهت رقتی که ایجاد می کند، در تست های شمارش سلولی CBC مورد استفاده قرار نگیرد.

شکل 5. لوله های سیتراته با درب آبی

4. اتیلن دیآمین تترا استیک اسید یا

EDTA
EDTA به اسامی تجاری Versene و Sequestrene نیز معروف است و فرمول ساختاری آن به صورت زیر است.

شکل 6. فرمول ساختاری EDTA

EDTA به وسیله عمل جذب و شیلاته کردن کلسیم یونیزه و حذف آن از محیط پلاسما باعث جلوگیری از انعقاد می شود. EDTA به علت حفظ ساختار و مورفولوژی سلول های خونی، به عنوان ضدانعقاد انتخابی برای آزمون شمارش سلولی CBC معرفی شده است. این ماده به شکل نمک های Na2EDTA (پودر)، K2EDTA (پودر) و K3EDTA (مایع) در بازار وجود دارد.

 

نمونه خون دفیبرینه

در این حالت از ضدانعقاد استفاده نمی شود ولی با روند دفیبرینیزاسیون، پروتئین های فیبرین و فیبرینوژن محلول در خون را که به عنوان سوبسترای اصلی انعقاد محسوب می شوند از پلاسما حذف نموده و درنتیجه امکان انعقاد را از خون سلب می کنند. برای این منظور خون را در لوله های شیشه ای حاوی ۱۰ تا ۲۰ بلور شیشه ای ریخته و به مدت ۱۰ دقیقه و به آرامی به هم می زنند تا فیبرینوژن و فیبرین جذب بلورها شوند. این روش با همولیز خفیفی همراه می باشد که استفاده از روش ملایم لوئیس و دیسی باعث کاهش مقدار همولیز می شود. در این روش خون را در یک ارلن کوچک ریخته و یک آژیتاتور ( agitator ) با انتهای مدور متصل به تکه های کوچک شیشه ای را در آن قرار داده و با دور آرام می چرخانند که باعث دفیبریناسیون خون می شود. در این روش حداقل همولیز وجود داشته و مورفولوژی سلول ها نیز دچار تغییر نمی شود.

عوارض ضدانعقادهای هماتولوژی

زمانی تصور بر این بود که بسیاری از تغییرات مورفولوژیکی گلبول های قرمز ناشی از مواد ضدانعقاد است ولی بررسی خون دفیبرینه فاقد ضدانعقاد ثابت کرد که همه تغییرات این چنین نبوده و عمدتاً در اثر ماندن خون در شرایط in vitro ایجاد می شوند. برخی از تغییرات مورفولوژیک نیز ناشی از اشکالات لام کشیدن بوده و به دلیل نامرغوبیت لام، سرعت نامناسب لام کشیدن، تکنیک های رنگ آمیزی و غیره ایجاد می شوند. البته ماندن زیاد خون در حضور ضدانعقادها (به ویژه سیترات) می تواند باعث کاهش سایت های گروه های خونی نیز شده و واکنش سرولوژیکی آنها را تضعیف کند. دوز بالای ضدانعقادها علاوه بر عوارض مختلف مورفولوژیکی و چروکیدگی سلولی، مانع از آگلوتیناسیون (agglutination ) صحیح نیز می شوند، لذا گاهی توصیه می شود که برای تست های گروه خونی، کراس مچ و همچنین جهت انجام تست LE از خون ضدانعقاددار کهنه استفاده نشود.

در نمونه های کهنه جهت تست های مذکور استفاده از خون لخته بهتر از خون حاوی ضدانعقاد عمل می کند. هرچه خون بیشتر بماند شروع به تغییرات مختلف مورفولوژیکی و عملکردی می کند و این اتفاقات در دمای RT(دمای اتاق) به مراتب بیشتر از دمای یخچال مشاهده می شود. شروع تغییرات عمدتاً از یک ساعت بعد از خو نگیری در دمای RT شروع شده و طی ۳ ساعت بعد از آن به حالت محسوس و مشخص درآمده و بعد از آن با افزایش زمان، تغییرات فاحشی مشاهده می شود که از آن جمله می توان به موارد زیر اشاره کرد:

1 . افزایش MCV گلبول های قرمز تا 3-4 fl به ازای هر ۱۲ ساعت و افزایش MPV پلاکت ها

2 . افزایش RDW و HDW

3 . کنگره دار شدن و تبدیل RBC ها به شکل اکینوسیت (burrcell ) و اسفروسیت (Spherocytes)

4 . تغییرات محسوس افزایش ESR

5 . کاهش تعداد رتیکولوسیت ها

6 . افزایش لوبولاسیون هسته لکوسیت ها و برگ شبدری شدن هسته نوتروفیل و لنفوسیت به طوری که سلولها شبیه مونوسیت می شوند.

7 . کاهش تعداد سایت های آنتی ژنی روی سلولها و تضعیف واکنشهای سرولوژیکی و بانک خون

8 . افزایش سلول های کاریورکسی (سلولهایی مرده با هسته تکه تکه شده) و افزایش جوانه زدن هسته لکوسیت ها

منبع: مجله اخبار آزمایشگاهی شماره 173