دسته بندی مطالب

غربالگری سلامت جنین غربالگری سلامت نوزادان غربالگری و پیشگیری از سرطان خدمات تشخیص پزشکی و بالینی خدمات ایمونولوژی و ایمونوفلورسانس خدمات پاتولوژی و سیتو پاتولوژی آموزش های همگانی و تخصصی همکاران و متخصصین آزمایشگاهی

آزمایش بررسی آنتی ژن های لکوسیتی انسانی (HLA)

| تعداد بازدید : 39

آنتی ژن های لکوسیت انسانی (HLAs)  مولکولهای سطح سلول هستند که در تمام سلولهای هسته یافت می شوند. هر فرد مجموعه بی نظیری از این آنتی ژن ها دارد که نیمی از آنها از هر والد به ارث رسیده و شناسایی آنها قبل از پیوند عضو مهم می شود سیستم HLA به عنوان یک مارکر اپیدمیولوژیک در انگشت نگاری DNA ، تعیین هویت و ابویت، سازگار بودن پیوند دهنده و گیرنده موثر است.

MHC در انسان یک گروه از ژن‌های کاملاً بهم چسبیده‌ای است که آنتی‌ژن‌های لکوسیت (گلبول های سفید) انسانی را کد می‌کنند. Zinkernagel و Dougherty در سال 1974 نشان دادند که لنفوسیتهای T باید MHC همان سلول حاوی آنتی ژن را داشته باشد تا پاسخ ایمنی را القا کنند.آنتی ژن های موجود در سطوح سلولی به گونه ای عمل می کنند که سیستم ایمنی بدن به آن ها واکنش نشان می دهد وکوچکترین تغییر جزیی روی این پروتئین ها توسط سیستم ایمنی شناسایی می شود.

 آزمایش بررسی آنتی ژن های لکوسیتی انسانی (HLA)

فنوتیپ HLA یک فرد شامل مجموعه ای از پروتئین های خاص HLA می باشد که توسط ژن های موجود در کمپلکس سازگاری بافتی)MHC(  قابل انعطاف پذیری، که بر روی سطح بیشتر سلول های بدن نمایش داده می شود ، رمزگذاری شده است. اگرچه بیش از 40 ژن در منطقه HLA قرار دارد ، ما فقط آن ژنهایی را بررسی می کنیم که آنتی ژن های پیوند کلاسیک را رمزگذاری می کنند (یعنی مواردی که نتیجه پیامد پیوند را تحت تأثیر قرار می دهند). این آنتی ژن ها شامل مولکول های MHC کلاس I HLA-A) ، HLA-B و HLA-C) و مولکول های MHC کلاس II HLA-DR )، HLA-DQ و HLA-DP )می باشد. برای ده ها سال ، نوع HLA کلاس I بصورت ایمونولوژیکی با استفاده از آنتی سرم های به دست آمده از افراد حساس به آنتی ژن های HLA از طریق بارداری ، تزریق  یا پیوند یا با آنتی بادی های مونوکلونال تعریف شده است. در این روش، لنفوسیت های زنده، که باید HLA تایپ شوند، با صفحات گسترده ای از این آنتی سرم ها کشت و مکمل می شوند. هنگامی که یک سلول آنتی ژن HLA خاصی را بیان می کند که توسط یک آنتی سرم خاص مشخص می شود، آنتی بادی ها مکمل را به هم متصل کرده و آن را فعال می کنند، با استفاده از این روش، می توان تعدادی از خصوصیتی مکانهای HLA-A ، HLA-B و HLA-C را تعریف کرد. این درجه ی بالا از پلی مورفیسم، از ویژگی های بارز سیستم HLA است

آنتی ژن های لکوسیت انسانی (HLAs)

سیستم آنتی ژن Leukocyte آنتی ژن  (HLA) در Chromosome 6 یکی از پلی مورفیسم ترین مناطق ژنوم انسان و یکی از مناطق بسیار مورد مطالعه در پیوند و ارتباط با بیماری های خود ایمنی، عفونی و التهابی مورد اهمیت است. ناحیه HLA حاوی ژنهایی است که محصولات پروتئینی را برای پاسخ ایمنی تطبیقی ضروری می کند و چندشکلی ژنتیکی بالای آن به سیستم ایمنی بدن اجازه می دهد تا با انواع عوامل ایجاد کننده بیماری مبارزه کند. سیستم ژن HLA در پیوند سلولهای بنیادی خونساز (HSCT)  و جایی که بیماران و اهدا کنندگان با توجه به ژن های HLA در کنار هم قرار می گیرند تا از حداکثر احتمال پیوند موفقیت آمیز استفاده کنند نقش مهمی را ایفا می کند. در این رابطه آلل های کشف شده و توالی های آنها به همراه جدیدترین اطلاعات در مورد منطقه HLA در پایگاه داده IMGT / HLA فهرست بندی شده است. از سه ماهه اول سال 2012 ، بیش از 1700 ، 2300 و 1000 آلل برای مکان های کلاس I-HLA-A ، -B و کلاس II HLA-DRB1 کشف شده اند.

 

نامگذاری آلل های HLA

توسط کمیته نامگذاری سازمان بهداشت جهانی  (WHO) برای عوامل سیستم HLA تنظیم می شود. هر نام آلل با نام مکان آن (به عنوان مثال A ، B ، DRB1 ، و غیره) شروع می شود و به دنبال آن حداقل دو مجموعه رقم وجود دارد. مجموعه اول مربوط به خانواده آلل است، اغلب با گروه های آنتی ژن همراه است، و مجموعه دوم مربوط به پروتئین خاصی در گروه است (به عنوان مثال آلل A * 02: 01 در محل A یافت می شود، متعلق به خانواده آلل"02" است و توسط پروتئینی به نام "01" کدگذاری می شود). در صورت لزوم، اگر نامهای آلل طولانی ترباشد، در مجموع چهار مجموعه رقم مشخص می شود. مجموعه سوم ارقام برای نشان دادن تعویض مترادف در منطقه کد نویسی استفاده می شود ، و از مجموعه چهارم ارقام برای نشان دادن تفاوت در مناطق غیر کد کننده ژن استفاده می کنند. براین اساس روشهای تایپ HLA مبتنی بر DNA توسعه داده شد و آزمایش سرولوژی HLA مجموعه ای از آللها با واکنش مشابه را شناسایی کرد. در حال حاظردر آزمایشگاه بررسی سطح دو رقمی پایین ترین وضوح تایپ HLA است که امروز گزارش شده است. برای این قالبهای با وضوح پایین، آللها در خانواده مشابه A * 01: 01 به عنوان A1 با استفاده از روشهای سرولوژیکی مخفف (SERO) گزارش می شوند، یا به عنوان یک نتیجه کوتاه از تایپ مبتنی بر DNA سطح متوسط ارائه میشود.

 

تقسیم بندی HLA

MHC به سه ناحیه مجزا موسوم به کلاس I ، II و III تقسیم می شود که ژن های HLA در مناطق کلاس I و کلاس II قرار دارند. نقش بیولوژیکی مولکولهای کلاس I و کلاس II ارائه آنتی ژنهای پپتید فرآوری شده است.ژن HLA شناخته شده ترین پلی مورفیسم ژنوم انسان است. این پلی مورفیسم عمدتاً در شش ژن کلاسیک HLA یافت می شود: ژنهای کلاس I A ، B وC و ژنهای کلاس II DRB1 ، DQB1 و DPB1  می باشد.تاکنون بیش از 12200 آلل HLA شناسایی شده است که بیش از 9200 نوع آن از ژنهای کلاس HLA کلاس I می باشد. مولکول های کلاس II فقط در لنفوسیت های B، سلول های حاوی آنتی ژن (مونوسیت ها، ماکروفاژها و سلول های دندریتیک) و لنفوسیت های T فعال شده بیان می شوند. ژن های کلاس III مولکول های HLA را رمزگذاری نمی کند، اما حاوی ژن هاییC2 ، C4، فاکتورB، 21-هیدروکسیلاز، فاکتورهای نکروز تومورTNFs  و .... می باشد.

 

کاربردهای بالینی HLA typing

نقش بیولوژیکی و اصلی مولکول های HLA در تنظیم پاسخ ایمنی است برای مثال در هنگام پیوند، فرد دهنده باید با فرد گیرنده سازگاری بافتی داشته باشد که جهت تایید این موضوع باید HLA Typing   انجام می شود. فاکتورهای زیادی جهت دریافت عضو اهدا کننده وجود دارد که یکی از این فاکتورها تطابق بینHLA  بیمار با اهدا کننده است. هرچقدراین قرابت بیشتر باشد پاسخ به پیوند بیشتر است . و خطر عارضه پس از پیوند به نام بیماری پیوند علیه میزبان  (GVHD) ایجاد نمی شود.سیستم ایمنی بدن از این نشانگرها برای تشخیص اینکه سلول ها در بدن ما فعالیتی دارند یا خیر استفاده می کند. برای مثال:

  • پیوند کلیه :جهت پیوند کلیه بررسی  HLA همسان برای فرد اهدا کننده با افراد در لیست انتظار پیوند کلیه

  • پیوند سلولهای بنیادی خون ساز: زیرا به خوبی مشخص است که درجه تطابق HLA بین اهدا کننده و گیرنده تأثیر معنی داری بر خطر بروز عوارض جانبی جدی مرتبط با این فرآیند دارد.

  • کمک در تشخیص بیماری های مرتبط با HLA.

  • جهت پیوند مغز استخوان یا بند ناف: که در این رابطه  MHCحاوی بیشترین اطلاعات برای عرضه مناسب آنتی ژن ها می باشد که درسطح تمام سلول های هسته دار بدن وجود دارند و بهترین گزینه برای بیماران مبتلا به لوسمی لنفوم و کم خونی داسی شکل می باشد.

 

روش انجام HLA  

  • مولکولی به صورت STR-PCR

از سه فرآیند اصلی برای انجام تایپ HLA استفاده می شود. اولین روش سرولوژیک معمولی است که در آن نمونه های لنفوسیت (گرفته شده از خون یا طحال به روش دانه های مغناطیسی) به صفحات Terasaki اضافه می شوند. این صفحات چاههای جداگانه ای دارند که حاوی آنتی بادی های مختلفی هستند (از سرم های مادری یا آنتی بادی های مونوکلونال تولید شده). بهترین سلول ها برای تایپ کلاس II لنفوسیت های B هستند و تایپ کلاس I با لکوسیت های باقیمانده نیز قابل انجام است. اگر آنتی ژن HLA و آنتی بادی اختصاصی به هم متصل شوند، و مکمل اضافه شود، سلول های موجود در آن چاه کشته می شوند. الگوی چاه هایی که این مرگ سلولی را نشان می دهند، این استنباط را دارد که ترکیبی از آنتی ژن های HLA در سلولهای بافت اصلی وجود داشته است.

روش بالقوه دیگر که برای تایپ HLA استفاده می شود ، فلوسیتومتری جریان است، به خصوص هنگام جستجوی آلل های خاص. در اینجا لکوسیتهای تازه هسته شده به آنتی بادی های مونوکلونال اضافه می شوند که با یک مولکولی که فلورسانس می شود، برچسب زده می شوند. سلولهای دارای آنتی ژن سطح که به آنتی بادی متصل می شوند فلورسنت می شوند. فلوسیتومتر جریان سلول های فلورسنت را با شناسایی نوری که از آنها عبور می کند با عبور از پرتوی لیزر تشخیص می دهد. فیتومتری جریان حدود 30 دقیقه طول می کشد. ( زمان لازم برای آماده سازی سلول ها و سپس اجرای دستگاه).

فرآیند سوم در حالی است که تایپ کردن بسیار دقیق لازم باشد، مثلاً برای تطبیق دقیق در پیوند مغز استخوان . این فرایند شامل استخراج DNA از سلولها و تقویت ژنهایی که برای پپتیدهای HLA رمزگذاری می شوند با استفاده از تکنیک های واکنش زنجیره ای پلیمراز است. ژنها ممکن است با توالی های شناخته شده نوکلئوتیدی HLA که در چندین بانک اطلاعات بانکی ژن، از جمله بانک اطلاعاتی IMGT / HLA ذخیره شده اند، همسان شوند. در خانواده هایی که قصد بررسی وضعیت HLA قبل از پیوند را دارند  HLA Typing به روش مولکولی با استفاده از STRبرای اعضا یک خانواده جهت پیدا کردن فرد مناسب برای اهدای عضو، مانند پیوند مغز استخوان، بسیار مناسب است، چنانچه فرد دارای یک خواهر و یا یک برادر باشد طبق قوانین وراثتی ٢٥% احتمال شباهت وجود دارد. با افزایش تعداد خواهر و برادرها شانس شباهت افزایش می باید. برای مثال فرد اگر دوخواهر یا برادر داشته باشد شانس شباهت ٤٤% و با داشتن ٣ خواهر یا برادر حدود ٥٧% است. با افزایش تعداد خواهر و برادران احتمال یافتن اهداکننده در بین آنان نیز افزایش می‌یابد. ممکن است فردی تعداد خواهران و برادران زیادی داشته باشد اما شانسی برای شبیه بودن کامل آنتی‌ژن های HLA با آنها نداشته باشد، در نتیجه با بررسی STR های متصل به ژن های HLA ، سازگاری HLA در نمونه ها بررسی می شود. HLA به روش مولکولی تنها روش برای تعیین سازگاری در تشخیص قبل از باروری می باشد.

 

شرایط نمونه دریافتی

نمونه خون باید هپارینه باشد و حداقل حجم مورد نیاز برای سنجش HLA Typing  مقدار 3 سی سی می باشد.

 

مراحل انجام  HLAاز طریق DNA

 

شکل1: مراحل انجام HLA از طریق خون

ارتباط  HLAبا بیماری

مکانیسم های HLA برای هر بیماری کاملاً توضیح داده نشده است، و ارتباط آن برای بیماریهای مختلف متفاوت است. با این وجود، دو دسته کلی مکانیسم وجود دارد الگویی از پاسخگویی سیستم ایمنی، یا عدم پاسخگویی به سیستم ایمنی که این دو مکانسیم بسته به توانایی مولکول های HLA هر فرد در انتخاب عوامل تعیین کننده آنتی ژن و ارائه پپتیدهای آنتی ژنی به لنفوسیت T متفاوت می باشد. زیرا ژنهای HLA کلاس I و HLA کلاس II با گیرنده های سلول (TCR) سلولهای CD8 + Tc و CD4 + Th از طریق مکانیسم پاسخ ایمنی با واسطه سلول و هومورال تعامل دارند.

 

 

References

1. Oxford textbook of medicine. 3rd edn. Oxford: Oxford University press; 1996. Immune mechanisms in health and disease; pp. 139–189. [Google Scholar]


نویسندگان

اعظم جمالی، زهرا کاظم زاده ، واحد تحقیق و توسعه آزمایشگاه پاتوبیولوژی و ژنتیک اریترون

تماس با ما


اریترون یک آزمایشگاه تخصصی است که از راه های مختلف می‌توانید با آن در تماس باشید و پرسش ها و مشکلات خود را به آسانی با متخصصین ما در میان بگذارید.

 

ساعت کار آزمایشگاه از 06:30 صبح الی 10 شب به طور یکسره و روزهای تعطیل از 7 صبح الی 8 شب

اصفهان / خیابان شیخ صدوق شمالی / خیابان شیخ مفید غربی

جواب آزمایش خود را به آسانی از طریق ربات تلگرامی به آدرس erythronlab_bot@ دریافت نمایید.

شماره تماس:7-36631906- 031    2 -36633621 - 031

شماره فکس: 89784728- 021

med@Erythron-lab.com

کد پستی : 76351-81647